一种耐高温几丁质酶及其应用制造技术

本发明专利技术生物技术领域，具体涉及一种几丁质酶及其应用。本发明专利技术所述的几丁质酶，其氨基酸序列选自如下（A1）或（A2）：（A1）氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；（A2）将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与（A1）所示的蛋白质具有相同功能的蛋白质。本发明专利技术得到的几丁质酶，最适温度为80℃，并且具有良好的热稳定性，且水解效率较高，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高温几丁质酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种耐高温几丁质酶及其应用。

技术介绍

[0002]几丁质是在地球上除纤维素之外的第二丰富的可再生天然高分子多聚物，主要分布于甲壳类动物的壳、无脊椎动物的角质层、昆虫的外骨骼和真菌细胞壁中。几丁质的分子量大，高度有序的结构中有大量的氢键，结晶程度高，因此不溶于水，这也限制了几丁质的应用。将几丁质降解为分子量较低的可溶于水的几丁寡糖才能最大化的实现几丁质的应用价值。传统的几丁质降解依赖于化学方法，工业上一般使用浓盐酸将几丁质降解为单糖。盐酸浓度和反应温度越高，反应速率越快。但是该方法很难产生聚合度较高的聚糖。此外，化学降解法耗能大，会产生大量污染废水，对环境威胁大。相比之下，用几丁质酶水解几丁质的反应条件温和，可直接水解结晶几丁质，既节能又环保。因此，该方法具有广泛工业应用前景。
[0003]几丁质的水解产物及其衍生物具有生物相容性和广泛的药理活性具有很高的应用和经济价值。据报道，几丁寡糖可预防肿瘤生长、治疗哮喘、改善骨骼强度、预防疟疾，并可在基因治疗中用作传递基因的载体。几丁寡糖的生物活性包括抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫调节、控制血压和降低胆固醇的作用。而且几丁六糖已经被证明具有更大的生物活性，包括抗菌、抗肿瘤和增强免疫的作用。
[0004]到目前为止，许多几丁质酶已经被鉴定和酶学表征，例如来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、巴伦氏类芽孢杆菌(Paenicibacillusbarengoltzii)、粘细菌(Corallococcussp)、圆叶茅膏菜(Drosera rotundifolia)、苜蓿链霉菌(Streptomyces alfalfae)、白长链霉菌(Streptomyces albolongus)的几丁质酶。然而，它们大多是中温的几丁质酶，不能满足苛刻的工业应用的条件。嗜热酶是一类在60℃至125℃的高温下仍保持高活性的酶。相较于中温酶，嗜热酶具有独特的优势，例如高催化活性、热稳定性好、较长储存时间(在室温下)、对有机溶剂的耐受性好。嗜热酶更稳定，可以使用更长的时间，从而降低了生物技术中的用酶成本。此外，在高温下降解聚合物有很多好处，例如：随着温度的升高，有机物的粘度降低，扩散系数和溶解度增大，从而提高反应速率，并降低细菌污染的风险。因此挖掘具有较好热稳定性和较高酶活性的嗜热酶对工业应用至关重要。
[0005]嗜热菌来源的几丁质酶拥有极高的最适温度和较好的热稳定性，例如Thermococcus chitonophagus的几丁质酶Tc
‑
ChiD的最适温度为90℃，在100℃下的半衰期为48min。来源于Thermococcus kodakaraensisKOD1的几丁质酶ChiAΔ5和ChiAΔ4的最适温度分别为85℃和90℃，其中ChiAΔ4在100℃的半衰期在7h以上。虽然这些嗜热几丁质酶具有较好的热稳定性，但是他们的酶活力和催化效率却都很低。

技术实现思路

[0006]针对现有问题的不足，本专利技术的目的是提供一种高活性的耐热几丁质酶及其应
用。本专利技术的几丁质酶ActChi，最适反应条件为80℃，在高温下仍能保持较高活性，为嗜热酶。
[0007]本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：
[0008]运用宏转录组技术，我们在堆肥高温阶段发现一个具有高转录水平的几丁质酶ActChi，它由malectin结构域、Fn3结构域和催化结构(CD
chi
)域组成。该几丁质酶ActChi(全长)包含624个氨基酸。
[0009]具体的，所述几丁质酶ActChi，其氨基酸序列选自如下(A1)或(A2)：
[0010](A1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0011](A2)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与(A1)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白质。
[0012]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本专利技术的编码蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术的分离得到的蛋白质的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质且具有蛋白质功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。
[0013]作为本申请的优选技术方案，所述几丁质酶ActChi来源于放线菌。
[0014]本专利技术还保护生物材料，所述生物材料可为下述(B1)
‑
(B4)中的任一种：(B1)编码几丁质酶ActChi的DNA分子；
[0015](B2)含有(B1)所述DNA分子的表达盒；
[0016](B3)含有(B1)所述DNA分子的重组载体、或含有(B2)所述表达盒的重组载体；
[0017](B4)含有(B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有(B2)所述表达盒的重组微生物、或含有(B3)所述重组载体的重组微生物。
[0018]作为本申请的优选技术方案，所述(B1)中，DNA分子选自如下(C1)或(C2)：
[0019](C1)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0020](C2)与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
[0021]本专利技术所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、病毒载体等，具体如载体pCold
‑
TF。
[0022]本专利技术所述的微生物可为酵母，细菌或真菌等。
[0023]本专利技术还保护一种几丁质酶突变体Fn3
‑
CD
chi
，将前文所述的几丁质酶ActChi删除malectin得到。
[0024]优选的，所述Fn3
‑
CD
chi
的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0025]本专利技术还保护一种几丁质酶突变体CD
chi
，将前文所述的几丁质酶ActChi删除malectin和Fn3得到。
[0026]优选的，所述CD
chi
的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0027]本专利技术还保护一种融合几丁质酶ChBD
‑
CD
chi
，所述融合几丁质酶ChBD
‑
CD
chi
的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0028]所述融合几丁质酶ChBD
‑
CD
chi
对结晶几丁质的水解活性提高了4倍。
[0029]本专利技术还保护一种提高前文所述的几丁质酶对结晶几丁质的水解活性的方法，将几丁质结合结构域ChBD合成到权利要求1所述的几丁质酶ActChi催化结构域CD
chi
的N端，得
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种几丁质酶ActChi，其氨基酸序列选自如下（A1）或（A2）：（A1）氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；（A2）将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与（A1）所示的蛋白质具有相同功能的蛋白质。2.生物材料，所述生物材料可为下述（B1）
‑
（B4）中的任一种：（B1）编码几丁质酶ActChi的DNA分子；（B2）含有（B1）所述DNA分子的表达盒；（B3）含有（B1）所述DNA分子的重组载体、或含有（B2）所述表达盒的重组载体；（B4）含有（B1）所述DNA分子的重组微生物、或含有（B2）所述表达盒的重组微生物、或含有（B3）所述重组载体的重组微生物；优选的，（B1）所述DNA分子选自如下（C1）或（C2）：（C1）核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；（C2）与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%或以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。3. 一种几丁质酶突变体Fn3
‑
CD
chi
，其特征在于，将权利要求1所述的几丁质酶ActChi删除malectin得到；优选的，所述Fn3
‑
CD
chi
的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。4. 一种几丁质酶突变体CD
chi
，其特征在于，将权利要求1所述的几丁质酶ActC...

【专利技术属性】
技术研发人员：万群，沈其荣，孙博，刘东阳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：