一种耐受离子液和醇类的酸性纤维素酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐受离子液和醇类的酸性纤维素酶及其应用。涉及基因工程技术领域。包括提供了其氨基酸、核苷酸序列及其应用。本发明专利技术提供的纤维素酶最适反应温度为55℃，最适反应pH为5.6～6.0，在0～30％离子液浓度下保持50％以上相对活性，在10％不同醇类下保持80％以上相对活性。在离子液处理后的桦木木屑和玉米芯水解体系中，产物中葡萄糖含量分别提高90％和35％以上。可应用于食品、饲料、纺织以及工业生产等行业中，提高离子液处理后木质纤维素的降解率，生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。维素酶。维素酶。

【技术实现步骤摘要】
一种耐受离子液和醇类的酸性纤维素酶及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种耐受离子液和醇类的酸性纤维素酶及其应用。

技术介绍

[0002]纤维素是地球上一种可再生有机碳，是植物生物量中最丰富的组成部分，占植物干重的35～50％。纤维素的水解需要多种纤维素酶的协同作用，可分为三大类:内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)和β
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葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。这些酶共同作用，将纤维素分解成更小的低聚糖，葡萄糖作为最终产物。纤维素酶在纺织、纸浆漂白、生物能源生产以及人类食品和动物饲料制备方面具有潜在的用途。
[0003]纤维素酶在自然界中广泛存于细菌、古菌、真菌、和动物体内。目前，用于生产的纤维素酶主要来自于真菌，如木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)。但它们都存在一定的劣势，如离子液残留或有醇类存在时酶活性低、不耐盐碱环境等，而在食品加工、饲料处理、离子液预处理木质纤维素、纤维素乙醇生产等对于耐受离子液和醇类的纤维素酶具有非常大的潜在需求，因此，需要进一步挖掘获得新的耐受离子液和醇类纤维素酶。
[0004]因此，提供一种纤维素酶，具有耐受离子液和醇类等特点，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种耐受离子液和醇类的酸性纤维素酶及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种耐受离子液和醇类的纤维素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了一种编码上述耐受离子液和醇类的纤维素酶的基因，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供了包含上述编码耐受离子液和醇类的纤维素酶的基因的重组载体。
[0010]优选的：重组载体的制备方法为将耐受离子液和醇类的纤维素酶的基因插入到质粒pET
‑
28a上的EcoRⅠ和HindⅢ限制性酶切位点之间得到重组质粒。
[0011]本专利技术还提供了包含上述编码耐受离子液和醇类的纤维素酶的基因或上述重组载体的重组菌株。
[0012]优选的：重组菌株为：用重组质粒转化大肠杆菌即得。
[0013]本专利技术还提供了上述耐受离子液和醇类的纤维素酶在食品、饲料、纺织以及工业生产中的应用。
[0014]优选的：纤维素酶用于水解离子液处理后的木质纤维素。
[0015]述基因、上述的重组载体或上述重组菌株在产业化生产耐受离子液和醇类的纤维素酶中的应用。
[0016]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种耐受离子液和醇类的酸性纤维素酶及其应用，取得的技术效果为本专利技术提供了纤维素酶基因(B4
‑
Cel5)，携带该基因的重组质粒以及重组菌株，该纤维素酶基因可以编码出一种纤维素酶，该酶最适反应温度为55℃，最适反应pH为5.6～6.0，在0～30％离子液(1
‑
乙基
‑3‑
甲基咪唑乙酸盐)浓度下保持50％以上相对活性，在10％不同醇类(甲醇、乙醇、异丙醇)下保持80％以上相对活性。可应用于食品、饲料、纺织以及工业行业中，提高离子液处理后木质纤维素的降解率，解决纤维素资源利用率低的问题。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0018]图1附图为本专利技术提供的纤维素酶基因PCR扩增电泳图，其中，泳道第1条为Marker，片段由上到下依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp、100bp，泳道第2条为扩增目的基因条带。
[0019]图2附图为本专利技术提供的纤维素酶SDS
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PAGE电泳图，泳道1为Marker，片段由上到下依次是180KD、130KD、100KD、70KD、55KD、40KD、35KD、25KD，其中泳道2为IPTG诱导的E.coli BL21/pET
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28a
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B4
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Cel5总蛋白、泳道3为B4
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Cel5纯化重组酶。
[0020]图3附图为本专利技术提供的温度对纤维素酶B4
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Cel5活性的影响示意图。
[0021]图4附图为本专利技术提供的不同温度对纤维素酶B4
‑
Cel5稳定性的影响示意图。
[0022]图5附图为本专利技术提供的pH对纤维素酶B4
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Cel5活性的影响示意图。
[0023]图6附图为本专利技术提供的不同pH缓冲液对纤维素酶B4
‑
Cel5稳定性的影响示意图。
[0024]图7附图为本专利技术提供的不同浓度离子液(IL)对纤维素酶B4
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Cel5活性的影响示意图。
[0025]图8附图为本专利技术提供的不同浓度离子液(IL)对纤维素酶B4
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Cel5稳定性的影响示意图。
[0026]图9附图为本专利技术提供的不同浓度NaCl对纤维素酶B4
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Cel5活性的影响示意图。
[0027]图10附图为本专利技术提供的不同醇类(甲醇、乙醇、异丙醇)纤维素酶B4
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Cel5活性的影响示意图。
[0028]图11附图为本专利技术提供的纤维素酶B4
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Cel5对离子液处理后桦木木屑(A)和玉米芯(B)水解后葡萄糖产量的影响示意图。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]本专利技术实施例公开了一种耐受离子液和醇类的酸性纤维素酶及其应用。
[0031]实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。例如：
[0032]基因：实施例在对新疆自治区克拉玛依盐碱地(45.56104
°
N,85.20898
°
E)采集的沙土样品进行富集培养和宏基因组测序后，通过生物信息学分析并筛选出纤维素酶的功能基因，并对该功能基因进行PCR扩增、鉴定、克隆表达、纤维素酶的纯化和酶学性质，克隆表达载体pET
‑
28a(+)。
[0033]酶类及其他生化试剂：限制性内切酶(EcoRⅠ和H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐受离子液和醇类的纤维素酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种编码权利要求1所述耐受离子液和醇类的纤维素酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.包含权利要求2所述编码耐受离子液和醇类的纤维素酶的基因的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的制备方法为将耐受离子液和醇类的纤维素酶的基因插入到质粒pET
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28a上的EcoRⅠ和HindⅢ限制性酶切位点之间得到重组质粒。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹以瑞，杨力权，李韬，桑鹏，黄裕颖，刘全林，闫鑫，饶孟迪，朱倩，王丽娟，宋荣欢，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：