β-葡萄糖苷酶突变体及其在昆布二糖制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了β

【技术实现步骤摘要】
ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种编码上述β
‑
葡萄糖苷酶突变体的基因。
[0010]本专利技术还提供了携带上述基因的表达载体。
[0011]本专利技术还提供了携带上述基因或者上述表达载体的微生物细胞。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于细菌、真菌细胞。
[0013]本专利技术还提供了一种制备昆布二糖的方法，所述方法为将上述β
‑
葡萄糖苷酶突变体添加至含有高浓度葡萄糖的反应体系中进行反应，得到反应液；从反应液中分离得到低聚半乳糖。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述β
‑
葡萄糖苷酶突变体的加酶量为：300
‑
700U/g葡萄糖。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系中，底物乳糖的浓度为500
‑
1000g/L。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的pH为5.8
‑
6.2。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的pH为6.0。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的温度为75
‑
85℃
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的温度为80℃。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的时间为2
‑
8h。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应的时间为6h。<br/>[0022]本专利技术还提供了上述突变体或上述基因或上述表达载体或上述微生物细胞在制备昆布二糖中的应用。
[0023]有益效果
[0024]本专利技术的β
‑
葡萄糖苷酶突变体制备昆布二糖产率和纯度均较野生型有了明显的提高。其中，最优组合突变体W324M/H298F在最优条件下合成昆布二糖最高产率可达11.41％，产物浓度达到91.3g/L，高于目前已有报道。
附图说明
[0025]图1：β
‑
葡萄糖苷酶突变体W324M/H298F酶转化产物分析。A，加酶量对昆布二糖产物的影响；B，各产物积累的时间进程曲线。
具体实施方式
[0026]下述实施例中涉及的4
‑
硝基苯基β
‑
D
‑
吡喃葡萄糖苷、葡萄糖均购自上海维塔化学试剂有限公司，大肠杆菌JM109感受态细胞购自上海生工。
[0027]下述实施例中涉及的培养基如下：
[0028]LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
[0029]LB固体培养基：在LB液体培养基基础上，添加琼脂：10g/L。
[0030]TB液体发酵培养基：酵母粉24g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨12g/L，K2HPO4·
3H2O 16.43g/L，KH2PO42.31 g/L。
[0031]下述实施例中涉及的检测方法如下：
[0032]β
‑
葡萄糖苷酶酶活力的测定：
[0033]反应体系为1mL，pH 5.0的醋酸缓冲液960μL，加入适度稀释(以反应终止时反应液
405nm吸光值在0.2
‑
1.2范围为宜)的粗酶液20μL，再加入20μL 100mmol/L的pNPG，在60℃恒温水浴中反应10min，10min后立即加入200μL的1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，冰浴5min，于405nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。
[0034]酶活单位定义：每毫升酶液每分钟水解pNPG产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。
[0035]相对酶活计算方法：酶活＝(A
405
+0.002)*反应体系*稀释倍数/(0.0074*反应时间*加酶量)
[0036]β
‑
葡萄糖苷酶催化合成昆布二糖、龙胆二糖反应体系及产物含量的检测方法：
[0037]使用pH 6.0的磷酸
‑
柠檬酸缓冲液溶解配置不同浓度的葡萄糖底物，向其中加入酶液，加缓冲液补充10mL。反应离心管放入一定温度的水浴摇床中，1500rpm反应，不同时间点取样，取样样品煮沸灭活，离心取上清液，用超纯水稀释后，使用高效液相色谱分析产物。
[0038]检测方法：使用安捷伦1200液相色谱仪示差检测器检测，色谱柱规格为HYPERSILAPS2色谱柱(250
×
4.6mm，5μm)，设置柱温为35℃，流速为0.8mL
·
min
‑
1，流动相为78％的乙腈/水溶液。
[0039]昆布二糖产率的计算：昆布二糖产率＝昆布二糖质量浓度/底物葡萄糖质量浓度*％
[0040]实施例1：野生型β
‑
葡萄糖苷酶基因的表达
[0041]含有野生型β
‑
葡萄糖苷酶的重组枯草芽孢杆菌菌株B.subtilis/pBSMμL3
‑
Tsbgl1A为实验室前期构建(构建方法记载于公开号为CN111411117A的中国专利申请的实施例2，【0071
‑
0077段】)。
[0042]参照公开号为CN111411117A的中国专利申请进行野生型β
‑
葡萄糖苷酶的诱导表达，从实验室前期保藏的甘油管中，接种重组枯草芽孢杆菌菌株B.subtilis/pBSMμL3
‑
Tsbgl1A于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)生长8h，得到种子液，按5％(v/v)接种量将种子液接入TB液体发酵培养基(含10mg/L四环霉素)，在37℃培养2h，再转入33℃摇床继续培养发酵24h后，得到发酵液；将发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，向菌体中加入50mL的50mM pH 6.0柠檬酸
‑
磷酸氢二钠缓冲液，充分重悬菌体后，使用高压匀浆机破壁，10000rpm离心20min后，收集破壁上清液即为粗酶液，OD
600
为5的粗酶液的酶活为10.41U/mL。
[0043]实施例2：β
‑
葡萄糖苷酶单突变体的构建及表达
[0044](1)突变体的制备
[0045]根据核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型β
‑
葡萄糖苷酶的基因序列，设计并合成H298F、H298M、T246Q、T246R、W324F、W324M和W324L突变引物，对野生型β
‑
葡萄糖苷酶进行定点突变，并分别测序确认β
‑
葡萄糖苷酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入枯草芽孢杆菌中进行表达，得到β
‑
葡萄糖苷酶突变体。
[0046]定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以携带编码β
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
‑
葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
‑
葡萄糖苷酶的第298位、246位和/或324位氨基酸突变得到的。2.根据权利要求1所述的β
‑
葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β
‑
葡萄糖苷酶突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
‑
葡萄糖苷酶的第298位组氨酸突变为苯丙氨酸，将第324位由色氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为W324M/H298F；将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
‑
葡萄糖苷酶的第298位组氨酸突变为甲硫氨酸，将第324位由色氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为W324M/H298M；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
‑
葡萄糖苷酶的第246位由苏氨酸突变为精氨酸，第324位由色氨酸突变为甲硫氨酸得到的，命名为W324M/T246R。3.编码权利要求1或2所述β
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏伟，吴敬，盛玲玲，霍润甜，许俊勇，史玉萍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：