壳聚糖酶及其编码基因、重组载体、重组菌株、发酵剂和酶制剂以及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术，公开了一种壳聚糖酶及其编码基因、重组载体、重组菌株、发酵剂和酶制剂以及它们的应用。该壳聚糖酶的纯酶活力高，具有明显的酸稳定性，在最适pH为5.0条件下过夜保藏，酶活力仅下降8％，在pH为3.0

【技术实现步骤摘要】
壳聚糖酶及其编码基因、重组载体、重组菌株、发酵剂和酶制剂以及它们的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程技术，具体涉及一种壳聚糖酶及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种发酵剂，一种壳聚糖酶的制备方法，一种酶制剂，以及它们在降解壳聚糖中的应用。

技术介绍

[0002]壳寡糖是一种无毒害、环境友好、可降解的海洋生物新材料，由甲壳素脱乙酰化的产物——壳聚糖经降解获得，聚合度通常介于2
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10之间。壳寡糖是自然界中唯一的天然碱性寡糖，具有抗菌、抗肿瘤、免疫调节和改善糖脂代谢等生物学活性，从而具备促进食品质量和人类健康的潜在能力，在食品、农业及医药领域中有着广泛的应用前景。工业上制备壳寡糖主要是由虾、蟹壳经浓盐酸、氢氧化钠脱钙、脱蛋白得到壳聚糖后，再经化学法、物理法或酶法水解得到。传统的壳寡糖制备工艺须用到大量强酸、强碱处理，存在能耗高、环境污染严重的缺点，给后期处理带来巨大的环保压力。
[0003]壳聚糖酶(EC 3.2.1.132，壳聚糖N
‑
乙酰氨基葡萄糖水解酶)是专一性水解壳聚糖的糖苷水解酶，通常以内切方式切割β
‑
1,4
‑
糖苷键生成壳寡糖。采用酶解法制备壳寡糖，具有专一性、高效性和环保性等优点，拥有良好的工业应用潜力。目前，已有多个来源于细菌和真菌的壳聚糖酶基因被克隆表达并及分子改造，在酶学性质和发酵条件优化等方面取得了显著的提升。但由于工业上酶解制备壳寡糖的催化环境普遍为酸性，大大制约了壳聚糖酶的催化效率以及壳寡糖的产率。<br/>[0004]目前对耐酸性壳聚糖酶的研究较少，李甜等从连云港海州湾泥样中筛选到一株产耐酸性壳聚糖酶芽孢杆菌CLT08，该菌株产壳聚糖酶活力为3.17U/mL，最适pH为4.0，在不同pH孵育2h后，pH 3.0
‑
5.0的剩余酶活在70％以上，pH&gt;5时酶活力急剧下降。该菌株产壳聚糖酶活力较低，且其耐酸区间较小，在壳寡糖制备工业中的应用潜力有限。因此，获得酶活高、酸稳定性强的壳聚糖酶仍是充分发挥其在壳寡糖制备工业中应用的关键。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种壳聚糖酶及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种发酵剂，一种壳聚糖酶的制备方法，一种酶制剂，以及它们在降解壳聚糖中的应用，该壳聚糖酶能够通过细菌表达，具有酶活力高、耐酸性强的优点。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种壳聚糖酶，所述壳聚糖酶为(a)
‑
(e)中任意一项所述的酶：
[0007](a)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酶；
[0008](b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有壳聚糖酶活性的氨基酸序列所示的酶；
[0009](c)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有壳聚糖酶活性的氨基酸序列所示的酶；
[0010](d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
[0011](e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
[0012]优选地，所述壳聚糖酶为与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上，优选95％以上同源性，且具有壳聚糖酶活性的氨基酸序列所示的酶。
[0013]本专利技术第二方面提供一种编码壳聚糖酶的基因，该基因具有编码如上所述的壳聚糖酶的核苷酸序列。
[0014]优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
[0015]更优选地，所述基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0016]本专利技术第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。
[0017]优选地，所述重组载体的表达载体为pET28a质粒。
[0018]本专利技术第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有如上所述的基因或者如上所述的重组载体。
[0019]优选地，所述重组菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。
[0020]更优选地，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0021]本专利技术第五方面提供一种发酵剂，所述发酵剂含有如上所述的重组菌株。
[0022]优选的，相对于每克所述发酵剂，所述重组菌株的含量为107ꢀ‑
109CFU。
[0023]本专利技术第六方面提供一种壳聚糖酶的制备方法，该方法包括：将如上所述的重组菌株和/或如上所述的发酵剂接种至发酵培养基中进行发酵，对发酵产物进行分离纯化，得到壳聚糖酶。
[0024]优选地，所述发酵培养基含有：蛋白胨10
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15g/L、酵母粉20
‑
30g/L、甘油8
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12g/L、KH2PO
4 1
‑
3g/L、K2HPO
4 3
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8g/L、卡那霉素40
‑
60mg/L；
[0025]所述发酵的过程包括：按8
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10体积％的接种量将种子液转接到所述发酵培养基中，在温度为30
‑
45℃、转速为150
‑
200rpm的条件下培养至OD
600
为0.6
‑
0.8，然后向培养液中加入乳糖至其终浓度为8
‑
10g/L，在温度为28
‑
30℃、转速为140
‑
180rpm的条件下进行诱导培养8
‑
10h。
[0026]本专利技术第七方面提供一种酶制剂，该酶制剂含有如上所述的方法制备得到的壳聚糖酶。
[0027]本专利技术第八方面提供如上所述的壳聚糖酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组菌株、如上所述的发酵剂、如上所述的方法制备得到的壳聚糖酶和如上所述的酶制剂中的至少一种在降解壳聚糖中的应用。
[0028]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0029]本专利技术提供的壳聚糖酶纯酶活力高达1200U/mg，并具有明显的酸稳定性，在最适pH为5.0条件下过夜保藏，酶活力仅下降8％，在pH为3.0
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6.0区间内保藏过夜，剩余酶活力在60％以上，该壳聚糖酶的耐酸性能较高，耐酸区间较大，在壳寡糖制备工业中具有较大的应用潜力。
[0030]本专利技术提供的重组菌株能够经高密度发酵高效生产壳聚糖酶，发酵液中壳聚糖酶的酶活力可达957U/mL，具有工业化应用前景。
附图说明
[0031]图1是实施例2中壳聚糖酶BTc01诱导表达及纯化的SDS
‑
PAGE电泳检测结图；
[0032]图2是实施例2中壳聚糖酶BTc01的最适pH曲线图；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶，其特征在于，所述壳聚糖酶为(a)
‑
(e)中任意一项所述的酶：(a)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酶；(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有壳聚糖酶活性的氨基酸序列所示的酶；(c)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有壳聚糖酶活性的氨基酸序列所示的酶；(d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；(e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。2.根据权利要求1所述的壳聚糖酶，其特征在于，所述壳聚糖酶为与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上，优选95％以上同源性，且具有壳聚糖酶活性的氨基酸序列所示的酶。3.一种编码壳聚糖酶的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1或2所述的壳聚糖酶的核苷酸序列；优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列；更优选地，所述基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的基因；优选地，所述重组载体的表达载体为pET28a质粒。5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求3所述的基因或者权利要求4所述的重组载体；优选地，所述重组菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌；更优选地，所述重组菌株的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。6.一种发酵剂，其特征在于，所述发酵剂含有权利要求5所述的重组菌株；优选的，相对于每克所述发酵剂，所述重组菌株的含量为107‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：张莹莹，林昌宇，付永前，尹丰伟，林昌敏，郑伟龙，
申请(专利权)人：浙江金壳药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：