本发明专利技术涉及一种携带人Ｅ１Ａ激活基因阻遏子（ｈＣＲＥＧ）基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的ｈＣＲＥＧ基因的真核表达载体，本发明专利技术还涉及所述真核表达载体用于制备重组ｈＣＲＥＧ蛋白及糖基化位点突变的ｈＣＲＥＧ蛋白，两种蛋白抑制血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ，ＶＳＭＣｓ）增殖的作用及用于制备对ＰＣＩ术后再狭窄具有抑制作用的药物及其用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核 表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体， 本专利技术还涉及所述真核表达载体用于制备重组hCREG蛋白及糖基化位 点突变的hCREG蛋白，两种蛋白抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs )增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有 抑制作用的药物及其用途。
技术介绍
蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的重要方式，生物体 内大约50%的蛋白质都是糖基化蛋白，包括酶、载体蛋白、激素、毒素、 各种凝集素和结构蛋白。糖基化蛋白中的蛋白质是其生理功能的主要 承担者，而糖链则通过识别和调控作用直接影响蛋白质的整体构象， 进而影响由构象决定的蛋白质的生物学功能。由于多糖分子自身存在 的高可变性，使得由不同宿主细胞、不同培养条件以及不同纯化工艺 所制备的重组糖蛋白的糖基形式存在显著差异。这种糖基化形式的变 异对糖蛋白正常的理化性质和生物学功能都存在严重的影响，从而制 约了重组糖蛋白工程的发展。人CREG (human cellular repressor of ElA-stimulated gene, hCREG )基因是1998年哈佛医学院Gill克隆的一个细胞分化调控基因 (Veal E， Mol Cell Biol, 1998; 18 (9): 5032-5041 )。本室前期研 究证实，hCREG蛋白表达能明显抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌 细胞-HITASY的增殖并促进其分化(Han Ya-Ling， Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology,2005; 21 (5): 570-574; Han Ya—Ling, Prog Biochem Biophys，2004 ; 31 (12):1099—1105 ; HanYa-Ling， Prog Biochem Biophys， 2005; 32 (6): 517-522 )。同时， 经外膜包裹导入的pLNCX2-hCREG逆转录病毒有效抑制了球嚢拉伤后 小鼠颈动脉狭窄的发生(Han Ya-Ling ， Chinese Journal of Pathophysiology (already accepted, to be published) ) 。 Veal 等的研究发现hCREG为分泌型糖蛋白，其蛋白结构中含有三个N-连接 的糖链，可与细胞膜胰岛素样生长因子受体2 ( IGF2R)的6-磷酸甘露 糖(M6P)配基结合，通过自分泌和旁分泌发挥其生物学功能(Veal E， Oncogene, 2000; 19 (17): 2120-2128 )。上述研究提示，hCREG糖蛋 白可能是诱导VSMCs分化的重要调控因子，在临床经皮腔内冠状动脉 介入治疗术后再狭窄的防治研究中具有潜在意义。作为分泌型糖蛋白，hCREG蛋白合成过程中进行正确的糖基化修 饰是其具有正常结构和功能的保证。据文献报道，CREG诱导的细胞生 长抑制依赖于M6P/IGF2R， M6P/IGF2R优先与糖基化的CREG结合，只 有极少量与非糖基化的CREG结合(Alessandra Di Bacco， Oncogene, 2003; 22 (35): 5436-5445 )。为准确表达重组hCREG糖蛋白的结构和功能，本研究构建了 pcDNA3. lmyc -His/hCREG真核表达载体及糖基化位点突变的 pcDNA3. lmyc-His/hCREG真核表达栽体，并选择了外源性蛋白的人胚胎 肾工程细胞系293F进行重组hCREG/myc -His融合蛋白及糖基化位点突 变的融合蛋白的表达。两种蛋白可用于比较CREG的糖基化形式对其功 能的影响。糖基化的CREG蛋白能够最大限度地发挥其生物学功能；同 时，具有生物学功能的去糖基CREG蛋白也可应用原核表达载体制备， 满足大量生产的要求，从而克服糖基化的CREG蛋白必须应用真核表达 载体制备及产量较低的不足。
技术实现思路
本专利技术的一个方面，涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG) 基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核 表达载体，在本专利技术中，所述CREG基因是指人CREG基因，其序列如SEQ ID N0:1所示(参见GenBank登录号NM003851 ),糖基化位点突 变的CREG指第160、 193、 216位点氨基酸序列由N突变为A，此序列 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。真核表达载体为 pc腿3. 1 myc-His (美国Invitrogen公司)。本专利技术还涉及所述真核表达载体用于制备重组CREG蛋白及糖基 化位点突变的CREG蛋白，两种蛋白抑制VSMCs增殖的作用及用于制备 对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物的用途。重组的hCREG蛋白氨基酸序列如下MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAAPFEQKLISEEDLNMHTGHHH服叫(SEQ ID NO: 1 )糖基化位点突变的重组hCREG蛋白氨基酸序列如下 MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAAPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH& (SEQ ID NO: 2 )双化线大号字体标记为突变的糖基化位点。 本专利技术的SEQ ID NO: 1所对应的核苷酸序列如下 ATGGCCGGGCTATCCCGCGGGTCCGCGCGCGCACTGCTCGCCGCCCTGCTGGCGTC GACGCTGTTGGCGCTGCTCGTGTCGCCCGCGCGGGGTCGCGGCGGCCGGGACCACGGGGAC TGGGACGAGGCCTCCCGGCTGCCGCCGCTACCACCCCGCGAGGACGCGGCGCGCGTGGCCC GCTTCGTGACGCACGTCTCCGACTGGGGCGCTCTGGCCACCATCTCCACGCTGGAGGCGGT GCGCGGCCGGCCCTTCGCCGACGTCCTCTCGCTCAGCGACGGGCCCCCGGGCGCGGGCAGC GGCGTGCCCTATTTCTACCTGAGCCCGCTGCAGCTCTCCGTGAGCAACCTGCAGGAGAATC CATATGCTACACTGACCATGACTTTGGCACAGACCAACTTCTGCAAGAAACATGGATTTGA5TCCACAAAGTCCCCTTTGTGTTCACATAATGCTGTCAGGAACTGTGACCAAGGTGAATGAA ACAGAAATGGATATTGCAAAGCATTCGTTATTCATTCGACACCCTGAGATGAAAACCTGGC CTTCCAGCCATAATTGGTTCTTTGCTAAGTTGAATATAACCAATATCTGGGTCCTGGACTA CTTTGGTGGACCAAAAATCGTGACACCAGAAGAATATTATAATGTCACA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种携带人Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：３所示核苷酸序列的真核表达载体及一种携带Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：４所示核苷酸序列的真核表达载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩雅玲，孙鸣宇，栾波，康健，张效林，闫承慧，
申请(专利权)人：中国人民解放军沈阳军区总医院，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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