【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含HLA
‑
G抗原结合结构域的蛋白质及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求于2020年7月29日提交的美国临时申请序列号63/057,960的优先权。上述申请中的每一者的公开内容全文以引用方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。2021年7月12日创建的所述ASCII副本命名为JBI6358WOPCT1_SL.txt，大小为747KB。
[0005]本公开提供了包含结合人白细胞抗原G(HLA
‑
G)蛋白的抗原结合结构域的蛋白质、编码它们的多核苷酸、载体、宿主细胞、制备和使用它们的方法。
技术介绍
[0006]人白细胞抗原G(HLA
‑
G)属于非经典MHC Ib类蛋白质家族。描述了七种可替代的mRNA，其编码四种膜结合的(HLA
‑
G1、G2、G3、G4)和三种可溶性(HLA
‑
G5、G6、G7)蛋白质同种型(Carosella等人，2003)。与高多态性经典HLA I类基因相反，HLA
‑
G基因多态性非常有限。仅列出了编码16个全长蛋白质的HLA
‑
G的50个等位基因。HLA
‑
G1及其可溶性对应物HLA
‑
G5具有相同的细胞外结构，其为经典的HLA I类样：三个球状结构域的重链非共价结合β2
‑>微球蛋白(β2m)并且适于结合限制性肽诸如组蛋白H2A肽1‑3。HLA
‑
G1单体在其肽结合沟(HLA分子的激活功能的关键结构元件)及其α3结构域(HLA
‑
I类分子的抑制功能的关键结构元件)的水平上不同于经典的HLA
‑
I类分子。膜同种型的蛋白水解脱落另外产生可溶性分子(Dong等人，2003；Park等人，2004)。已经报道了HLA
‑
G的单体、同源多聚体和可能的异源多聚体以及泛素化蛋白质的结构。认为HLA
‑
G的抑制功能主要是由于二聚体而不是单体阻断作为最佳表征受体的人抑制性受体Ig样转录物2和4(ILT2和ILT4)。HLA
‑
G1同源二聚体采取暴露α3结构域的ILT2和ILT4结合位点的倾斜取向，从而以比HLA
‑
G单体更高的亲和力和更慢的解离速率结合。
[0007]已知的HLA
‑
G受体包括抑制性受体ILT2(在单核细胞、DC、B细胞、以及自然杀伤和T细胞亚组上表达)和ILT4(仅由骨髓单核细胞谱系的细胞表达)(它们是外周免疫细胞上的主要HLA
‑
G受体(Colonna等人，1997，1998))、非抑制性受体CD8和CD160、以及KIR2DL4受体(其状态对于HLA
‑
G仍然是不明确的)。ILT2和ILT4识别并结合MHCI的α3结构域和β2m。
[0008]针对HLA
‑
G描述的大多数功能是免疫功能，尽管非免疫功能也已有报道，诸如抑制血管生成和骨生成。重复显示HLA
‑
G
–
ILT2相互作用抑制NK细胞功能，从而保护表达HLA
‑
G的细胞免受NK介导的细胞裂解。此外，HLA
‑
G直接抑制表达ILT
‑
2的T细胞(活化的和/或克隆的T细胞)和B细胞的功能。HLA
‑
G还诱导髓样APC的交替分化，诱导调节性髓样细胞和调节性T细胞的分化，并且抑制嗜中性粒细胞的吞噬功能。
[0009]肿瘤细胞可以利用HLA
‑
G抑制NK介导的细胞裂解、T细胞增殖和诱导调节细胞/抑制细胞所需的信号传导途径并由此逃避免疫系统的这种免疫抑制能力来逃避免疫监视，导
致具有更高侵袭和转移能力的细胞的不受控生长。HLA
‑
G不仅能够逃避宿主免疫监视，而且增强恶性肿瘤进展期间的转移。许多研究已经证明肿瘤HLA
‑
G表达(不在正常周围区域中)可能与疾病阶段或更糟的患者结果相关。HLA
‑
G表达与肿瘤进化和进展以及晚期肿瘤阶段、较高的侵袭和转移能力和不良临床预后有关。其异常表达与存活时间缩短相关。
[0010]虽然各种癌症显示HLA
‑
G的表达，但正常组织中的表达主要限于绒毛外细胞滋养层上的胎儿
‑
母体界面、胎盘、羊膜和特定健康成人组织诸如胸腺、角膜、支气管上皮细胞、胰腺和特定类型的细胞诸如间充质干细胞、活化的单核细胞、红细胞和内皮前体(综述于Carosella等人，2015)。
[0011]考虑到HLA
‑
G在正常组织中的有效且广泛的免疫抑制功能作用和限制性表达模式，HLA
‑
G可被指定为在过表达HLA
‑
G的实体瘤和B细胞恶性肿瘤中的有吸引力的治疗靶标。
[0012]在已生成的少数特异性抗HLA
‑
G抗体中，仅以下可用抗体结合天然细胞表达的HLA
‑
G(87G、MEM
‑
G9、MEM
‑
G11、G223)。这些抗体对HLA
‑
G与配体ILT
‑
2和/或ILT
‑
4相互作用的抑制百分比即使在高剂量的相应抗体下也不完全。此外，尽管已经描述了特别是87G抗体能够增强体外肿瘤杀伤，但是没有报道通过施用该抗体体内阻断HLA
‑
G的功效。
[0013]需要用于治疗和诊断目的的下一代HLA
‑
G结合结构域。
技术实现思路
[0014]本专利技术提供了强烈阻断HLA
‑
G与其同源受体ILT
‑
2和/或ILT
‑
4之间的结合的特异性抗HLA
‑
G单克隆抗体。所生成的抗HLA
‑
G抗体在不存在与经典MHC I类分子的交叉反应性的情况下结合重组或内源HLA
‑
G蛋白。根据我们的知识，本专利技术的抗体是第一HLA
‑
G特异性抗体，其证明了对HLA
‑
G的特异性和与HLA
‑
A、HLA
‑
B、HLA
‑
C和HLA
‑
E没有交叉反应性；和/或完全阻断HLA
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G与ILT
‑
2/4配体的相互作用。此外，本专利技术的抗体展示了在体内施用后的肿瘤生长抑制。
[0015]本专利技术还涉及此类抗体或包含衍生自这些抗体的可变结构域的蛋白质的用途，以便通过接合免疫系统(通过阻断HLA
‑
G与免疫抑制配体的相互作用或通过Fc或双特异性蛋白质介本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含结合人白细胞抗原G(HLA
‑
G)的抗原结合结构域，其中所述结合HLA
‑
G的抗原结合结构域包含：a)SEQ ID NO:50的重链可变区(VH)的重链互补决定区(HCDR)1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:51的轻链可变区(VL)的轻链互补决定区(LCDR)1、LCDR2和LCDR3；或者b)SEQ ID NO:52的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:53的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者c)SEQ ID NO:54的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:55的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者d)SEQ ID NO:56的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:57的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者e)SEQ ID NO:58的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:59的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者f)SEQ ID NO:60的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:61的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者g)SEQ ID NO:62的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:63的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者h)SEQ ID NO:64的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:65的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者i)SEQ ID NO:66的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:67的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者j)SEQ ID NO:68的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及SEQ ID NO:69的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。2.根据权利要求1所述的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：a)分别为SEQ ID NO:70、71、72、88、89和90；b)分别为SEQ ID NO:73、71、74、91、89和92；c)分别为SEQ ID NO:75、76、77、93、89和94；d)分别为SEQ ID NO:78、79、80、95、89和96；e)分别为SEQ ID NO:81、82、83、97、89和98；f)分别为SEQ ID NO:78、71、84、99、89和100；g)分别为SEQ ID NO:78、71、84、101、89和100；h)分别为SEQ ID NO:85、86、87、102、103和104；或者i)分别为SEQ ID NO:78、71、84、95、89和96。3.根据权利要求1或2所述的分离的蛋白质，其中所述结合HLA
‑
G的抗原结合结构域是scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab
’
)2、Fd、dAb或VHH。4.根据权利要求3所述的分离的蛋白质，其中所述结合HLA
‑
G的抗原结合结构域是所述Fab。5.根据权利要求3所述的分离的蛋白质，其中所述结合HLA
‑
G的抗原结合结构域是所述scFv。
6.根据权利要求5所述的分离的蛋白质，其中所述scFv从N末端到C末端包含VH、第一接头(L1)和VL(VH
‑
L1
‑
VL)或者所述VL、所述L1和所述VH(VL
‑
L1
‑
VH)。7.根据权利要求6所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含：a)约5个至50个氨基酸；b)约5个至40个氨基酸；c)约10个至30个氨基酸；或者d)约10个至20个氨基酸。8.根据权利要求6所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的氨基酸序列。9.根据权利要求8所述的分离的蛋白质，其中所述L1包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述结合HLA
‑
G的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66或68的VH和SEQ ID NO:51、53、55、57、59、61、63、65、67或69的VL。11.根据权利要求10所述的分离的蛋白质，其中所述结合HLA
‑
G的抗原结合结构域包含：a)SEQ ID NO:50的VH和SEQ ID NO:51的VL；b)SEQ ID NO:52的VH和SEQ ID NO:53的VL；c)SEQ ID NO:54的VH和SEQ ID NO:55的VL；d)SEQ ID NO:56的VH和SEQ ID NO:57的VL；e)SEQ ID NO:58的VH和SEQ ID NO:59的VL；f)SEQ ID NO:60的VH和SEQ ID NO:61的VL；g)SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:63的VL；h)SEQ ID NO:64的VH和SEQ ID NO:65的VL；i)SEQ ID NO:66的VH和SEQ ID NO:67的VL；或者j)SEQ ID NO:68的VH和SEQ ID NO:69的VL。12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述结合HLA
‑
G的抗原结合结构域包含SEQ ID NO:265、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、266、267、268或269的氨基酸序列。13.根据权利要求1至12中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述蛋白质缀合至半衰期延长部分。14.根据权利要求13所述的分离的蛋白质，其中所述半衰期延长部分是免疫球蛋白(Ig)、所述Ig的片段、Ig恒定区、所述Ig恒定区的片段、Fc区、转铁蛋白、白蛋白、白蛋白结合结构域或聚乙二醇。15.根据权利要求1至14中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质是单特异性蛋白质。16.根据权利要求1至14中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质是多特
NO:371的LCDR1、SEQ ID NO:372的LCDR2和SEQ ID NO:373的LCDR3；b)SEQ ID NO:346的VH和SEQ ID NO:347的VL；c)SEQ ID NO:348的VH和SEQ ID NO:349的VL；d)SEQ ID NO:361的重链互补决定区1(HCDR1)、SEQ ID NO:362的HCDR2、SEQ ID NO:363的HCDR3、SEQ ID NO:367的轻链互补决定区1(LCDR1)、SEQ ID NO:368的LCDR2和SEQ ID NO:369的LCDR3；e)SEQ ID NO:339的VH和SEQ ID NO:340的VL；f)SEQ ID NO:361的HCDR1、SEQ ID NO:362的HCDR2、SEQ ID NO:363的HCDR3、SEQ ID NO:367的LCDR1、SEQ ID NO:368的LCDR2和SEQ ID NO:370的LCDR3；g)SEQ ID NO:339的VH和SEQ ID NO:341的VL；h)SEQ ID NO:339的VH和SEQ ID NO:342的VL；i)SEQ ID NO:339的VH和SEQ ID NO:343的VL；j)SEQ ID NO:339的VH和SEQ ID NO:344的VL；或者k)SEQ ID NO:339的VH和SEQ ID NO:345的VL。37.根据权利要求19至36中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。38.根据权利要求19至37中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段包含导致所述蛋白质与Fcγ受体(FcγR)的结合减少的至少一个突变。39.根据权利要求38所述的分离的蛋白质，其中导致所述蛋白质与所述FcγR的结合减少的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：L234A/L235A/D265S、F234A/L235A、L234A/L235A、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、F234A/L235A、S228P/F234A/L235A、N297A、V234A/G237A、K214T/E233P/L234V/L235A/G236
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缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、H268Q/V309L/A330S/P331S、S267E/L328F、L234F/L235E/D265A、L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和S228P/F234A/L235A/G236
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缺失/G237A/P238S，其中根据EU索引进行残基编号。40.根据权利要求19至37中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段包含导致所述蛋白质与所述FcγR的结合增强的至少一个突变。41.根据权利要求40所述的分离的蛋白质，其中导致所述蛋白质与所述FcγR的结合增强的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E，其中根据EU索引进行残基编号。42.根据权利要求38至41中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述FcγR是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIII或它们的任何组合。43.根据权利要求19至42中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区或所述Ig恒定区的所述片段包含调节所述蛋白质的半衰期的至少一个突变。44.根据权利要求43所述的分离的蛋白质，其中调节所述蛋白质的半衰期的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R，其中根据EU索引进行残基编号。
45.根据权利要求19至44中任一项所述的分离的蛋白质，其中所述蛋白质在所述Ig恒定区的CH3结构域中包含至少一个突变。46.根据权利要求45所述的分离的蛋白质，其中所述Ig恒定区的所述CH3结构域中的所述至少一个突变选自由以下项组成的组：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366Y、T366W、F405W、T394W、T394S、Y407T、Y407A、T366S/L368A/Y407V、L351Y/F405A/Y407V、T366I/K392M/T394W、F405A/Y407V、T366L/K392M/T394W、L351Y/Y407A、T366A/K409F、L351Y/Y407A、T366V/K409F、T366A/K409F、T350V/L351Y/F405A/Y407V和T350V/T366L/K392L/T394W，其中根据EU索引进行残基编号。47.一种分离的多特异性蛋白质，所述分离的多特异性蛋白质包含结合HLA
‑
G的第一抗原结合结构域和结合淋巴细胞抗原的第二抗原结合结构域。48.根据权利要求47所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述淋巴细胞抗原是T细胞抗原。49.根据权利要求47所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述T细胞抗原是CD8
+
T细胞抗原。50.根据权利要求47所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述淋巴细胞抗原是NK细胞抗原。51.根据权利要求47至50中任一项所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述淋巴细胞抗原是CD3、CD3 epsilon(CD3ε)、CD8、KI2L4、NKG2E、NKG2D、NKG2F、BTNL3、CD186、BTNL8、PD
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1、CD195或NKG2C。52.根据权利要求51所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述淋巴细胞抗原是CD3ε。53.根据权利要求47至52中任一项所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述结合HLA
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G的第一抗原结合结构域和/或所述结合淋巴细胞抗原的第二抗原结合结构域包含scFv、(scFv)2、Fv、Fab、F(ab')2、Fd、dAb或VHH。54.根据权利要求53所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述结合HLA
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G的第一抗原结合结构域和/或所述结合淋巴细胞抗原的第二抗原结合结构域包含所述Fab。55.根据权利要求53所述的分离的多特异性蛋白质，其中所述结合HLA
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G的第一抗原结合结构域和/或所述结合淋巴细胞抗...
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