一种干细胞外泌体提取试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种干细胞外泌体提取试剂盒及其应用，所述试剂盒包括纳米磁珠、洗脱液和磁珠清洗液；所述纳米磁珠，用于从样品中捕获目标外泌体，所述纳米磁珠表面结合有多特异性抗原结合物；所述多特异性抗原结合物包括依次连接的抗CD9、CD81和EpCAM抗原结合片段。采用该试剂盒或方法，能够识别和获取表面具有特定抗原的干细胞外泌体，所述外泌体具有更强的促细胞增殖能力和抗氧化损伤能力；将差速离心法与免疫磁珠法相结合，避免了对昂贵大型设备的依赖，提供筛选干细胞外泌体的质量和效率；可调节细胞的炎症因子分泌水平，避免对机体正常细胞造成过度免疫损伤。常细胞造成过度免疫损伤。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞外泌体提取试剂盒及其应用

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[0001]本专利技术属于生物
，具体提供了一种干细胞外泌体提取试剂盒及其应用。

技术介绍
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[0002]1983年，研究人员在绵羊网织红细胞中发现了外泌体，但它们最初被认为是细胞废物，长期未受到业界重视；直到2007年，学者们发现这种纳米级囊泡内含有蛋白质、脂质和RNA(包括mRNA和miRNA)，可以作为发挥生物学功能的信号分子传递给其他细胞，展现了生物学研究和临床应用价值。研究发现，外泌体是具有纳米级双层膜的细胞外囊泡，其表面为磷脂双层，外泌体具有良好的稳定性和渗透性，在它们进入靶细胞后，外泌体可以调节细胞的生理功能和信号传导；外泌体在显微镜下呈杯状结构，直径范围为30至200nm，密度约为1.13
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1.19g/mL，外泌体可在
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80℃环境中长期储存，与新鲜分离的外泌体相比，在不同条件下长期保存的外泌体会出现不同程度的直径增大，并且观察到上清液中外泌体有不同程度的蛋白质泄漏现象；外泌体的分布相当广泛，几乎存在于所有体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新和多向分化的潜力，常见MSCs源自脂肪(AMSCs)、骨髓(BMSCs)、脐带(UCMSCs)和牙龈，MSCs自1968年发现以来引起了广泛关注，并已用于临床前研究多年。各种类型的间充质干细胞可以在正常和病理条件下分泌外泌体，外泌体由细胞内溶酶体颗粒内陷形成，通过内吞作用与内体膜和细胞膜融合后，通过旁分泌信号释放到细胞外基质中。尽管不同来源的MSC衍生的外泌体具有不同的产量，例如骨髓间充质干细胞比脂肪来源的间充质干细胞释放更多的外泌体；人羊水间充质干细胞外泌体的产量显著高于人骨髓间充质干细胞，但是其生理功能类似，如研究表明来自源自人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)的外泌体和源自骨髓的外泌体(human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs)的外泌体中60％的蛋白质是相同的，这些蛋白质与细胞生长和抗氧化应激有关，均可抑制肿瘤细胞的生长。
[0004]目前可用于有效分离外泌体的方法有以下几种：差速离心法、密度梯度离心法、沉淀法、冲洗分离法、超滤法、抗体亲和捕获法、微流体分离法和质谱法。
[0005]差速离心法，该方法的原理是根据外泌体的体积和物理特性分离外泌体与样品中存在的其他物质，将收集的样品以不同的速度离心以去除细胞、细胞碎片和大分子蛋白，然后以100000
×
g超速离心70分钟以获得上清液中的外泌体。差速离心是外泌体分离方法中的金标准，是从细胞生物液和培养上清液中提取外泌体最常用的方法，但尽管差速离心(包括超速离心)对于外泌体的分离是有效的，但对于研究实验室和临床环境来说，该技术耗时、劳动密集且严重依赖仪器，此外超速离心过程可能导致大量外泌体丢失，有降低产量的风险。此外，在分离效果上该方法也受到质疑，一方面该方法可能导致纯度不足，由于微泡和外泌体的鉴定没有统一的标准，这导致一些研究表明最终的离心产物是微泡而不是外泌体，因此其被认为不适合从少量血清样品中提取外泌体；另一方面，存在于外泌体上的蛋白
质和RNA成分在超速离心过程中受到较大影响，不利于后期利用，因此该方法主要适用于细胞上清液和尿液等较大样本以及蛋白质研究。
[0006]密度梯度离心法，在密度梯度区域离心中，将样品加入惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力作用下，样品的不同成分会沉降到它们的等密度区，从而实现外泌体与样品中其他成分的分离。该类方法中最常用的是蔗糖密度梯度离心法，将线性蔗糖梯度(0.25
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2.0M蔗糖)构建到超速离心管中，然后将样品沉积在该线性蔗糖梯度的顶部，然后将梯度溶液在4℃下以210000g超速离心，获得外泌体。与传统的超速离心法相比，该方法的优点是，首先它具有更高的分离效率，从而产生更高纯度的外泌体；其次外泌体颗粒在分离过程中不易被压碎或变形，防止分离后的成分再次混合。该方法的缺点是离心时间较长，终产物收率不高。此外，需要在运行该方法之前准备惰性梯度介质溶液，而且准备工作和方法本身都复杂且耗时，密度梯度离心所需的仪器也很昂贵，并且在实验室中占用大量空间，这使许多实验室无法实施该方法。
[0007]沉淀法，该方法将溶剂添加到溶液中以改变某些组分的极性和溶解度，从而使它们沉淀到溶液中。与差速离心法相比，沉淀法可以有效改善生物体液的分离效率，目前已经开发出了Serum
TM
、Exo
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Q和Exo
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Spin
TM
血细胞纯化试剂盒、mi
‑
RCURY外泌体分离试剂盒、Exo Quick
‑
TC Exosome
TM
沉淀溶液试剂盒、甲醇沉淀和总外泌体分离试剂盒等多种提取试剂盒。但这种方法由于使用沉淀试剂，使得外泌体的纯度受到影响。
[0008]冲洗分离法，该方法利用色谱分离原理，将样品添加到色谱柱的一端，使其吸附和溶解在固定相上，然后使用冲洗剂将样品从固定相上分离。这种方法具有时间和成本效益优势，大规模临床应用前景较好。但是，这种方法对于外泌体的吸附和冲洗分离难以完全，容易造成外泌体样品的浪费，不适用少量或痕量样本的分离和检测。
[0009]超滤法，利用超滤膜两侧的压力差作为驱动力，在一定压力下，原液流过膜表面，大体积颗粒被截留，而小体积颗粒可通过超滤膜，达到对原液的提纯、分离、浓缩。这种方法可以去除密度梯度离心难以去除的某些杂质，如非特异性AGO蛋白，但是超滤膜的分离孔易发生堵塞，使得处理效率逐渐降低，分离时间延长，不利于大量样品的处理。
[0010]免疫磁珠法，该方法中将特异性抗体固定于磁珠上，利用抗体
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抗原特异性结合能力，筛选和分离外泌体。该方法可特异性筛选表达某一种或多种特异性抗原的外泌体，有研究表明抗体亲和捕获法分离外泌体比离心法或密度梯度法更有效(Popovic M，Mazzega E，Toffoletto B，de Marco A.Isolation of anti
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extra
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cellular vesicle single
‑
domain antibodies by direct panning on vesicle
‑
enriched fractions.Microb Cell Factories.2018；17(1):6)，从而为特定疾病的诊断或治疗提供了解决方案。但是传统抗体结构复杂，生产成本高昂，限制了其应用范围。
[0011]微流控分离法，微流体技术是一种用于在微尺度水平上精确控制和操纵流体的方式，能够在微/纳米尺度空间中操纵流体，将反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多特异性抗原结合物，其特征在于：所述多特异性抗原结合物包括依次连接的抗CD9、CD81和EpCAM抗原结合片段；其中抗CD9抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，抗CD81抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，抗EpCAM抗原结合片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.根据权利要求1所述的多特异性抗原结合物，其特征在于：所述多特异性抗原结合物的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。3.一种干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括纳米磁珠、洗脱液和磁珠清洗液；所述纳米磁珠，用于从样品中捕获目标外泌体，所述纳米磁珠表面结合有权利要求1
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2任一项所述的多特异性抗原结合物；所述洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；所述磁珠清洗液，用于对外泌体进行洗涤。4.根据权利要求3所述的干细胞外泌体提取试剂盒，其特征在于：纳米磁珠的制备方法包括：使用PBS溶液洗涤羧基磁珠，然后加入1
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乙基
‑3‑
(3
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二甲基氨丙基)
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碳化二亚胺/N
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羟基琥珀酰亚胺溶液，室温下孵育30分钟；向磁珠溶液中加入所述多特异性抗原结合物，缓慢搅拌使其混合均匀，室温下反应3
‑
4h；使用PBS溶液清洗3次，磁吸分离后重悬于PBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：亓爱杰，李少波，陈清轩，韦素碧，
申请(专利权)人：诺赛联合北京生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：