成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物制造技术

本发明专利技术涉及成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物。本发明专利技术是基于人皮肤真皮层最重要的细胞成纤维细胞调节培养液中的外基质成分，进一步进行纯化检测和分离，最终制备出三型胶原蛋白，同时复配透明质酸，形成组合物配方。针对面颈部皱纹进行除皱填充的人群使用，属于移植技术的一种成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物制作技术。更具体而言，通过志愿者捐献的皮肤，进行体外成纤维细胞培养，从细胞培养上清液中制备人源胶原蛋白，经检测HIV、HBV、HCV、梅毒感染标志物检测的最终结论均为无反应性，支原体阴性，细菌检测阴性。最终产品，采用SDS

【技术实现步骤摘要】
成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物


[0001]本申请涉及生物领域，更具体的，涉及成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物。

技术介绍

[0002]细胞治疗是目前世界上生物医学治疗发展的热点之一。造血干细胞移植或自体体细胞或干细胞治疗由于低免疫原性的原因，是国内外最早推进于临床应用的治疗方案，美国FDA于十余年前批准了自体成纤维细胞在临床中的应用。在长达十余年的时间里面，进行自体成纤维细胞移植的案例多大几千例，目前已在临床应用中取得了丰硕的成果。在成纤维细胞体外培养、扩增、制备细胞悬液的过程中，会产生大量的细胞培养上清液，该细胞上清液中含有大量人成纤维细胞外基质，没有还没有比较好的针对胞外基质进行研究的报道。
[0003]细胞外基质主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，按分布部位划分主要分为基底膜(Basement membrane)和间质基质(Interstitial matrix)。胶原蛋白(Collagen)属于不溶性纤维形蛋白质，是细胞外基质的主要成分，遍布于各器官和组织。胶原蛋白一般占哺乳动物体内蛋白总量的25％(质量分数)。结缔组织中的胶原主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，Ⅳ型胶原主要存在于基底膜。胶原蛋白为动物结缔组织提供抗外张力的能力。其基本结构为三股胶原蛋白多肽链相互缠绕形成的三螺旋结构，直径为1.5nm。部分类型的胶原蛋白三螺旋可组合成相互平行的有序多聚体，称为胶原蛋白纤丝(collagen fibril)，其直径在10
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300nm，长度可达几μm。胶原蛋白纤丝可以进一步组装成直径为0.5
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3μm、长度为上百μm的胶原蛋白纤维(collagen fibre)，这是细胞外基质最主要的组成部分之一。胶原蛋白纤维的取向受成纤维细胞(fibroblast)控制。例如在腱组织中，成纤维细胞会牵引胶原纤维定向移动，使其按照组织中张力的轴线方向分布。另外一些类型的胶原蛋白起在胶原纤维表面进行修饰的作用，用以促进胶原纤维之间及它们与细胞外基质中其它成分如糖蛋白的连接。非胶原糖蛋白的共同特点是既可与细胞结合，又可与细胞外基质其他大分子结合，将细胞黏着于细胞外基质。ECM中的糖蛋白包括黏附蛋白中层黏连蛋白(LN)、纤维黏连蛋白(FN)、接触蛋白(ND)与抗黏附蛋白肌腱生长蛋白(Tenascin，TN)、骨黏连蛋白(BM
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40)、基底膜蛋白(Bamin)等，TN是ECM寡聚糖蛋白，BM
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40是一种富含半胱氨酸残基的ECM糖蛋白。蛋白聚糖与氨基聚糖又称蛋白多糖(Proteoglycan)、粘多糖(Mucopolysaccharide)，为一种糖蛋白。其糖链多为长链氨基多糖，许多长链氨基多糖连接在一蛋白质核心上而构成的糖蛋白。因其糖含量比蛋白质多许多，有时糖的含量可高达95％，故称为蛋白多糖。蛋白多糖是构成结缔组织的主要成分。构成蛋白多糖的氨基多糖有透明质酸、软骨质及硫酸软骨质、硫酸肤质、硫酸角质、肝素及硫酸乙酰肝素等。从结构看均为有羧基或硫酸基的带负电荷的聚糖，除透明质酸外，这些聚糖均以链式连接到核心蛋白分子，连接的聚糖可以是单一的链，也可以是多链的。
[0004]近日，美国密歇根大学一项研究表明，增加细胞外基质可以延缓衰老。通过填充的
方式引入细胞外基质组分。比如说玻尿酸注射中，通过直接向真皮层填充透明质酸来增加细胞外基质含量。但单一的多糖成分仅仅能维持一段时间的物理支撑，不足以诱导自身的细胞外基质合成。近期火热的童颜针，则是向真皮层引入聚乳酸微球，一方面提供力学支持，一方面也诱导局部炎症来刺激细胞外基质的合成。然而，炎症刺激往往难以控制，往往引发强烈的副作用。综合来看，目前最为理想的方式，是直接补充细胞外基质。相比于引入单一的成分外，引入细胞外基质整体能够更好的模拟实际的皮肤状况。除去提供力学支持外，细胞外基质更能起到再生的作用。基质中具有多元的组分，彼此协同从而重塑真皮层的微环境。通过调节皮肤微环境，一方面使得基质中各成分(胶原蛋白、弹性蛋白等)恢复健康的比例、结构与功能，另一方面也重塑了基质合成/降解的平衡状态。目前，国内可行的技术方案还比较少，需要进一步的优化。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于现有技术的需要，通过多年的实验研究，建立了一个从人成纤维细胞体外培养上清液中制备大量成纤维细胞外基质，再尔分离提取三型胶原蛋白的技术体系。
[0006]一方面，本方法是成纤维细胞外基质制备的三型/元胶原蛋白组合物的制作技术。更具体而言，通过志愿者捐赠的皮肤或单独无菌切取皮肤或者眼袋切除术、重睑术、除皱术等外科手术废弃或特意顺便切取的皮肤，进行体外模拟人体内环境下的真皮层成纤维细胞培养，从细胞培养上清液中制备成纤维细胞外基质浓缩液，采用SDS
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聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测，胶原提取物分子量位于45
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75KD之间经检测HIV、HBV、HCV、梅毒感染标志物检测的最终结论均为无反应性，支原体阴性，细菌检测阴性。成纤维细胞外基质提取分离的三型胶原与透明质酸按照不同比例复配，可进一步制备化妆品、药物和医用真皮填充物等医疗器械。
[0007]另外一方面，为了促进成纤维细胞的增殖以及胞外基质的分泌，提供了一种高活性的活性肽，其能够有效的促进成纤维细胞的增殖以及胞外基质的分泌。
[0008]进一步的，本专利技术的活性肽的序列如EMHKMEPCPMYRRHLG所示，所述活性肽是通过从多肽库中通过成纤维细胞模型筛选获得的，所述活性肽具有强刺激成纤维细胞增殖的特性，同时能够促进胞外基质和胶原蛋白的分泌。
[0009]进一步的，活性肽的N端乙酰化或C端酰胺，或者N端和C端的PEG修饰。
[0010]所述多肽通过Fmoc多肽合成法制备。
[0011]为了便于说明，本专利技术将上述多肽命名为HXT
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32。
[0012]其中，Fmoc多肽合成法制备为本领域技术人员制备多肽的常规方法。在本领域技术人员知道要制备的多肽需要包含如EMHKMEPCPMYRRHLG所示的氨基酸序列的情况下，再结合现有Fmoc多肽合成法，就可得到本专利技术要保护的多肽。所述多肽通过小鼠一般慢性毒理学研究的持续时间遵循ICH S4的指导持续时间为≥6个月，证实对小鼠无明显的毒副作用。
[0013]进一步的，本专利技术的多肽也可以通过生物技术与原核表达的方式来制备并获得。
[0014]进一步的，成纤维细胞外基质提取分离的三型胶原与透明质酸和活性肽按照不同比例复配，可以制备成为更高活性的组合物，在自身能够发挥作用的同时，还能够加快促进皮肤分泌胶原蛋白等活性物质，有利于皮肤抗衰老。
[0015]进一步的，本专利技术成纤维细胞是通过如下方式来源制备的：
[0016]1.志愿者捐献皮肤前，常规进行HIV、HBV、HCV、梅毒血清学检查，结果阴性的留取细胞培养上清液用于后续制备成纤维细胞外基质。阳性者丢弃；
[0017]2.单独无菌切取皮肤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种活性肽，其特征在于：氨基酸序列如EMHKMEPCPMYRRHLG所示。2.成纤维细胞外基质制备的三型胶原蛋白组合物，其特征在于：人皮肤成纤维细胞在含有200μg/mL权利要求1所述的活性肽的10％胎牛血清的DMEM/F12或在含有200μg/mL权利要求1所述的活性肽的无血清培养基中进行培养24h，收集到细胞培养上清液，将收集到的细胞培养液采用0.22μm滤膜过滤除菌，获得无菌性细胞培养液；采用超滤膜的分子量≤90KD以下，超滤系统进行外基质浓缩获得成纤维细胞外基质，将获得成纤维细胞外基质采用辐射灭菌方法进行病毒灭活，辐射灭菌最佳条件为60Co
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γ射线25Kgy即获得三型胶原蛋白，胶原蛋白分子量位于45
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75KD之间；将三型胶原蛋白与透明质酸和权利要求1所述的活性肽按照优化的7.3：2.5:0.2的比例进行复配，即制备得到了三型胶原蛋白组合物。3.如权利要求2所述的三型胶原蛋白组合物，其特征在于：人皮肤成纤维细胞的来源是通过皮肤分离制备获得，此处人...

【专利技术属性】
技术研发人员：亓爱杰，李少波，陈清轩，韦素碧，
申请(专利权)人：诺赛联合北京生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：