成体细胞衍生的类器官制备技术制造技术

本发明专利技术涉及成体细胞衍生的类器官制备技术。本发明专利技术通过筛选特定的抗原表位，并通过专有的杂交瘤技术产生抗GSK

Preparation of organoids derived from adult cells

【技术实现步骤摘要】
成体细胞衍生的类器官制备技术


[0001]本专利技术涉及生物领域，更具体的涉及成体细胞衍生的类器官制备技术。

技术介绍

[0002]类器官(Organoids)，即是指它类似于组织器官。其实，它本身是一种基于3D体外细胞培养系统建立的，与体内的来源组织或器官高度相似的一种模型。这些3D体外培养系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间、细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。而其本身又能做到与体内分化的组织器官具有相似的生理反应，与来源组织具有极高的相似性。与传统2D细胞培养模式相比，3D培养的类器官包含多种细胞类型，能够形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。
[0003]类器官用于生理状态下的研究，其材料可来源于多能干细胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)或成体干细胞。其中多能干细胞可来源于胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，而成体干细胞则一般来源于手术取材后的组织样本的分离提纯。正常组织类器官除了应用于生理性的研究如胚胎发育等之外，也可应用于肿瘤研究，包括致癌危险因素的机制研究和基因编辑条件下肿瘤类器官的建立。
[0004]类器官的研究主要集中于疾病模型，如发育相关问题，遗传疾病，肿瘤癌症等。通过使用患者的iPSCs可建立有价值的疾病模型，并能在体外模拟重现病人疾病模型；同时，类器官的建立可以实现对药物药效和毒性进行更有效、更真实的检测。由于类器官可以直接由人类iPSCs直接培养生成，相比于动物模型很大程度上避免了因动物和人类细胞间的差异而导致的检测结果不一致。
[0005]已有研究表明，干细胞通过定向分化，可以诱导分化为集合管和肾单位。输尿管芽也起源于中间中胚层，与一个相邻细胞群(即后肾间充质)相互作用，输尿管芽将产生输尿管树，从而形成输尿管、肾盂和集合管，而后肾间充质祖细胞会产生肾单位。输尿管上皮来源于中肾管的一个侧支，其本身形成于前中间中胚层，而后肾间充质来源后中间中胚层。细胞从原始条纹(体节中胚层)向头侧迁移形成中间中胚层。早期迁移的原始条纹细胞在成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor9，FGF9)刺激下形成输尿管上皮细胞，而肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂(CHIR99021)通过改变Wnt信号的持续时间刺激较晚迁移的原始条纹细胞，引起后肾间充质增加。根据此原理，2015年国外学者利用诱导多能干细胞的定向诱导分化获得了类肾器官。肖枫林等采用BM
‑
MSCs利用CHIR99021肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂以及通过细胞因子控制BM
‑
MSCs的分化，成功构建出类肾器官。由此可见，肝糖原合成激酶3β是形成类器官的关键步骤。
[0006]糖原合成酶激酶
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3(glycogensynthasekinase3，GSK
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3)是一种在进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，普遍存在于哺乳动物真核细胞中，除去最早发现的调控糖原合成酶(gloycogensynthase，GS)的活性外，GSK
‑
3β还能作用于众多信号蛋白、结构蛋白和转录因
子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。在癌症、神经退行性疾病、神经精神类疾病等多种重大疾病的研究中，选择其作为治疗靶点，受到越来越多研究者的重视。肝糖原合成激酶3β通路抑制剂目前种类很少，可选择类型还不多。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种特异性针对GSK
‑
3β单克隆抗体。所述抗体是采用特异性的优势抗原表位筛选获得的。
[0008]一方面，本专利技术提供了GSK
‑
3β
‑
D8单抗，其亲和力解离常数(Kd)为5.17
×
10
－10
，属于高亲和力抗体。
[0009]单抗的轻重链序列分别如下：
[0010]轻链可变区(SEQ ID NO：2)
[0011]DIVITQRPALMAASPGEKVTITCNKKECMKVQMCAWYQQKSGISPKPWIYHFAHNSYGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCTGWYLNFKGFGAGTKLELK
[0012]重链可变区(SEQ ID NO：3)
[0013]EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSACLYPWIKQRPGQGLEWIGGLPIMCFLPQRENNHMGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGEYYASANWGLGTTLAVSS。
[0014]优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少50％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少60％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少70％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少80％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少90％同源性的类似序列，优选地，重链可变区的氨基酸序列是与序列3具有至少99％同源性的类似序列。
[0015]优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少50％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少60％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少70％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少80％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少90％同源性的类似序列，优选地，轻链可变区的氨基酸序列是与序列2具有至少100％同源性的类似序列。
[0016]本公开包括编码GSK
‑
3β单克隆抗体的免疫球蛋白轻链和重链基因的核酸分子，包含这种核酸的载体，和能够产生本公开的抗GSK
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3β单克隆抗体的宿主细胞。
[0017]本专利技术的GSK
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3β单克隆抗体可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备。为了重组表达抗体，用携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达，任选地，分泌到培养宿主细胞的培养基中，从该培养基中可以回收抗体。使用标准的重组DNA方法获得抗体重链和轻链基因，将这些基因整合到重组表达载体中，并将载体导入宿主细胞中。
[0018]本公开的GSK
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3β单克隆抗体包括完整的分子和抗体片段(例如Fab和F(ab')2能特异性结合hpg.Fab和F(ab')的片段)2片段缺少完整抗体的Fc片段，从动物或植物的循环中更快地清除，并且可能具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性针对GSK
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3β单克隆抗体D8，所述抗体的轻重链序列分别如下：轻链可变区的序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO：3所示。2.权利要求1所述的单克隆抗体D8在在制备抑制GSK
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3β活性的药物组合物中的用途。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：亓爱杰，李少波，马润林，王凤芹，黄昱，
申请(专利权)人：诺赛联合北京生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：