一种双特异性抗体及其筛选方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种双特异性抗体及其筛选方法与应用，其中双特异性抗体是以人体IgG4

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性抗体及其筛选方法与应用


[0001]本专利技术涉及抗体
，具体涉及一种双特异性抗体及其筛选方法与应用。

技术介绍

[0002]IgG4通过抑制免疫反应，引发IgG4相关免疫性疾病，尤其是对肿瘤的生长有间接的促进作用。专利技术人有大量实验结果证明，肿瘤在生长过程中不仅诱发具有抗肿瘤生长的免疫抗体IgG1产生，同时也诱发具有协助肿瘤细胞逃逸免疫反应的IgG4产生。减少系统性IgG4和肿瘤周边IgG4，可以明显抑制肿瘤的生长。专利技术人的实验还证明了IgG4的免疫逃逸作用主要是通过两个机制达成的：(1)IgG4
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Fc段与IgG1
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Fc段结合，从而抑制免疫抗体IgG1与肿瘤受体的结合，降低或阻断了IgG1的抗肿瘤作用；(2)IgG4
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Fc段与免疫细胞如巨噬细胞、NK细胞等细胞膜上的Fc受体结合，从而竞争性阻断IgG1
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Fc与这些免疫细胞的Fc受体结合，也阻断了IgG1激活这些免疫细胞的免疫反应。专利技术人的实验还证明，IgG4
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Fc与Fc受体的亲和力弱于IgG1
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Fc，推断IgG4的免疫抑制作用可能以作用(1)为主。
[0003]参见图1所示的癌症引发的B淋巴细胞衍生的IgG4介导的免疫逃避机制的示意图。癌症抗原的慢性刺激诱导B淋巴细胞类型转换以产IgG4。这种增加的IgG4可以通过其Fc
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Fc结合特性与抗癌抗体IgG1的Fc结合，以及与免疫效应细胞的Fc受体结合，抑制IgG1和免疫效应细胞的作用。癌症微环境中增加的IgG4以其独特的结构和生物学特性，介导癌症的有效免疫逃逸。其中ADCC为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ADCP为抗体依赖性细胞吞噬作用；CDC为补体依赖性细胞毒性；NK为自然杀伤细胞(原图见Wang H,Xu Q,Zhao C,et al.An immune evasion mechanism with IgG4 playing an essential role in cancer and implication for immunotherapy.Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020；8:e000661.doi:10.1136/jitc
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2020
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000661)。
[0004]需要说明的是，公开于该
技术介绍
的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，用于理解专利技术人产生专利技术构思的背景，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0005]基于背景部分所述IgG4的免疫逃逸作用经由2个途径达成：(1)IgG4
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Fc段与固定化(immobilized)IgG1
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Fc段(或/和其他类型抗体的Fc段)结合；(2)IgG4
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Fc段与Fc受体结合。那么能够阻断IgG4
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Fc段上的这两个结合位点的化合物或抗体就可以阻断IgG4的免疫逃逸作用。由于这两个结合位点都是由多个氨基酸组成，并通过与其他抗体Fc段和Fc受体的多个氨基酸之间的不同化合键的结合，因此，筛选出两个特异性单克隆抗体(包括筛选出小分子，中分子，大分子(肽类)化合物)分别阻断IgG4
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Fc段上的两个结合部位，并将两个单克隆抗体或其Fab段的抗原结合域制成双特异性抗体，是研制阻断IgG4引发的免疫逃逸作用药物的最佳选择。
[0006]因此，本专利技术的目的在于提供一种能够阻断IgG4引发的免疫逃逸作用的双特异性
抗体和化合物药物的筛选方法及其应用。
[0007]所采用的技术方案为：
[0008]本专利技术的一种双特异性抗体，其是以人体IgG4
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Fc段上存在的与固定化IgG1
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Fc段的结合部位为抗原，筛选第一种单克隆抗体，用以阻断IgG4
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Fc段与固定化IgG1
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Fc段的结合；以IgG4
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Fc段上存在的与Fc受体结合部位为抗原，筛选第二种单克隆抗体，用以阻断IgG4
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Fc段与Fc受体的结合；把筛选到的两种单克隆抗体制成人源IgG1结构的双特异性抗体。
[0009]此方法也适用于筛选小分子，中分子和大分子(肽)化合物药物。
[0010]进一步地，所述人体IgG4
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Fc段的氨基酸序列包括IgG4
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CH2段和IgG4
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CH3段，是筛选特异性抗体的抗原氨基酸序列；其中IgG4
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CH2段的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；IgG4
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CH3段的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
[0011]进一步地，所述双特异性抗体使用人源IgG1抗体结构，或制备成无Fc段，或修饰此抗体，使抗IgG4
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Fc抗体与其他抗体Fc段之间不能相互结合,不能与Fc受体结合。
[0012]本专利技术的一种上述所述的双特异性抗体的筛选方法，包括如下步骤：
[0013]S1.筛选阻断IgG4
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Fc段与固定化IgG1
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Fc段结合的第一种单克隆抗体；
[0014]S2.筛选阻断IgG4
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Fc段与Fc受体结合的第二种单克隆抗体；
[0015]S3.结合步骤S1的第一种单克隆抗体和步骤S2的第二种单克隆抗体制备成双特异性抗体。
[0016]进一步地，步骤S1中，包括S11.制备人源IgG4
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Fc段作为抗原:
[0017]使用木瓜蛋白酶消化法打断IgG4的Fab段和Fc段之间的铰链，去除Fab段而制备；IgG4在半胱氨酸的存在下,37℃下混合木瓜蛋白酶5小时，IgG4在铰链区上被切断，生成IgG4
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Fab段和IgG4
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Fc段；然后用蛋白亲和层析法分离IgG4的Fab段和Fc段；然后使用洗脱液把Fc段从蛋白层析注上洗脱下来；
[0018]S12.制备抗IgG4
‑
Fc段的单克隆抗体
[0019]使用纯化的人源IgG4
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Fc段蛋白作为抗原，使用抗原特异性的淋巴细胞杂交瘤技术，制作抗IgG4
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Fc段单克隆抗体淋巴细胞株和单克隆抗体；
[0020]S13.筛选能够阻断固定化IgG1
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Fc与IgG4
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Fc结合，抗原
‑
抗体亲和力高的第一种单克隆抗体的筛选步骤如下:
[0021]S131.将人胰岛素包被于96或384
‑
孔盘；
[0022]S132.使用BSA阻断未包被的位点；
[0023]S133.使用抗人胰岛素抗体IgG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双特异性抗体，其特征在于，其是以人体IgG4
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Fc段上存在的与IgG1
‑
Fc段的结合部位为抗原，筛选第一种单克隆抗体，用以阻断IgG4
‑
Fc段与固定化的IgG1
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Fc段的结合；以IgG4
‑
Fc段上存在的与Fc受体结合部位为抗原，筛选第二种单克隆抗体，用以阻断IgG4
‑
Fc段与Fc受体的结合；把筛选到的两种单克隆抗体制成人源IgG1结构的双特异性抗体。2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述人体IgG4
‑
Fc段的氨基酸序列包括IgG4
‑
CH2段和IgG4
‑
CH3段，是筛选特异性抗体的抗原氨基酸序列；其中IgG4
‑
CH2段的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；IgG4
‑
CH3段的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体使用人源IgG1抗体结构，或制备成人源无Fc段抗体，或修饰此抗体，使抗IgG4
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Fc抗体与其他抗体Fc段之间不能相互结合,不能与Fc受体结合。4.一种权利要求1
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3任一所述的双特异性抗体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.筛选阻断人源IgG4
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Fc段与固定化人源IgG1
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Fc段结合的第一种单克隆抗体；S2.筛选阻断人源IgG4
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Fc段与人源Fc受体结合的第二种单克隆抗体；S3.结合步骤S1的第一种单克隆抗体和步骤S2的第二种单克隆抗体制备成双特异性抗体。5.根据权利要求4所述的双特异性抗体的筛选方法，其特征在于，步骤S1中，包括：S11.制备抗原IgG4
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Fc段，使用木瓜蛋白酶消化法打断IgG4的Fab段和Fc段之间的铰链，去除Fab段而制备；IgG4在半胱氨酸的存在下,37℃下混合木瓜蛋白酶5小时，IgG4在铰链区上被切断，生成IgG4
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Fab段和IgG4
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Fc段；然后用蛋白亲和层析法分离IgG4的Fab段和Fc段；然后使用洗脱液把Fc段从蛋白层析注上洗脱下来；S12.制备抗IgG4
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Fc段的单克隆抗体使用纯化的人源IgG4
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Fc段蛋白作为抗原，使用抗原特异性的淋巴细胞杂交瘤技术，制作抗IgG4
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Fc段单克隆抗体淋巴细胞株和单克隆抗体；S13.筛选能够阻断固定化IgG1
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Fc与IgG4
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Fc结合，抗原
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抗体亲和力高的第一种单克隆抗体的筛选步骤如下:S131.将人胰岛素包被于96或384
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孔盘；S132.使用BSA阻断未包被的位点；S133.使用抗人胰岛素抗体IgG1与96或384
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孔盘内包被的胰岛素结合，形成固定化IgG1，用缓冲液洗除未结合的IgG1；S134.使用人源IgG4
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FITC与制备的抗人IgG4
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Fc单克隆抗体预先孵育30分钟，然后加入到S133制备的94或384
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孔盘中；S135.在96或384
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孔盘中孵育30分钟后，用缓冲液冲洗；S136.使用读盘仪读取96或384
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孔盘的荧光；S137.不加抗IgG4
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Fc抗体的样本可得到最高读数，作为阴性对照，不加抗胰岛素抗体的样本可得到最低读数，作为阳性对照，筛选出能够阻断IgG4
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Fc段与IgG1
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Fc段结合的抗IgG4
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Fc段单克隆抗体和细胞克隆株；S138.筛选出亲和力最强的克隆：用连续稀释法挑选出对IgG4
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Fc与IgG1
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Fc结合阻断作用最强的单克隆抗体和细胞克隆株，得到阻断IgG4
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Fc段与固定化IgG1
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Fc段结合的第一
种单克隆抗体；S139.制备固定化IgG1...

【专利技术属性】
技术研发人员：富继义，顾江，
申请(专利权)人：富继义，
类型：发明
国别省市：