一种基于内标法的SARS-CoV-2表面抗原SERS检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于内标法的SARS

【技术实现步骤摘要】
一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法


[0001]本专利技术属于本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法。

技术介绍

[0002]在印度物理学家Raman发现拉曼散射后，经过将近一个世纪的发展，其中表面增强拉曼光谱(SERS)技术随着激光技术、计算机科学以及纳米科学等的发展，其高表面灵敏性，无需样品预处理、操作简便、检测速度快、准确率高、仪器便携等特点，SERS检测在食品安全、公共安全、国防安全、生物检测等领域起到了积极的作用。
[0003]新型冠状病毒感染病毒SARS
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CoV
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2的检测方法中的病原学及血清学检查主要有核酸检测、抗体检测、抗原检测。其中，核酸检测是SARS
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2检测的“金标准”，但存在耗时较长、无法现场检测的缺点。而抗体检测则需要一定的窗口期，难以实现感染者的早期诊断。
[0004]核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术从随机寡核苷酸文库中筛选出的一段短的、能与靶分子高特异性和高亲和力结合的单链核苷酸序列。核酸适配体享有“化学抗体”的美誉,与一般抗体相比,具有制备简单、性质稳定、靶标范围广、免疫原性低、易修饰等优势。随着核酸适配体筛选合成方法的进步,其下游应用范围也越来越广,如分析化学、生物传感、临床医学等领域。近年来,核酸适配体与纳米材料的结合大大提高了适配体传感器的性能。
[0005]相比核酸、抗体检测，新型冠状病毒SARS
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2抗原检测能够在新型冠状病毒感染的早期(1
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10天)进行检测，并且成本更低，速度更快，有望在15
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20分钟内获得结果。因此，抗原检测更适合于早期大规模筛查，能够与核酸检测、抗体检测、CT检测相互印证，成为新型冠状病毒感染排查的重要手段。新型冠状病毒感染病毒SARS
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2不断在突变，这给检测带来了更大的压力，同时现有的抗原检测试剂盒存在检测灵敏度不够导致假阴性等问题。
[0006]因而急需开发出一种更快速、检测灵敏度更佳并且能够检测突变后病毒的新的抗原检测手段。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于内标法的SARS
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2表面抗原SERS检测方法，利用修饰了乱序适配体以及信号分子的贵金属纳米颗粒来表征空白基底的信号，利用靶标信号与内标信号的比值来判断是否含有新型冠状病毒，利用便携式拉曼光谱仪，即可实现对新型冠状病毒SARS
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2表面抗原的快速检测。
[0008]为了实现以上目的，本专利技术的技术方案之一为：一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法，具体包括如下步骤：
[0009]S1：制备免疫磁珠捕获纳米粒子：将新型冠状病毒抗原的核酸适配体通过生物素
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链霉亲和素之间的特异性作用修饰在已经修饰了链霉亲和素的磁性微球上，以形成免疫磁珠捕获纳米粒子；
[0010]S2：制备金属纳米粒子；
[0011]S3：制备免疫金属信号纳米粒子：将步骤S2制备的金属纳米粒子与拉曼信号分子和巯基修饰的新型冠状病毒抗原的核酸适配体进行混合；并封闭活性位点，获得免疫金属信号纳米粒子；
[0012]S4:制备内标金属信号纳米粒子：将步骤S2制备的金属纳米粒子与内标信号分子和巯基修饰的乱序核酸适配体进行混合；并封闭活性位点，获得内标金属信号纳米粒子；
[0013]S5：三明治结构的制备：将步骤S1制备得到的免疫磁珠捕获纳米粒子、待测样本混合和步骤S3的免疫金属信号纳米粒子以及S4的内标金属信号纳米粒子一起进行混合孵育一定时间后进行磁吸分离，最终获得三明治结构；
[0014]S6：SARS
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2病毒的检测：将获得的含内标三明治夹心结构通过拉曼光谱仪进行拉曼检测，得到新型冠状病毒抗原的拉曼光谱结果。
[0015]新型冠状病毒SARS
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2抗原免疫磁珠捕获纳米粒子具有磁性并修饰能特异性识别新型冠状病毒SARS
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2抗原的适配体，免疫金属信号纳米粒子具备拉曼信号表达和SARS
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2抗原的适配体修饰，内标金属信号纳米粒子具备内标信号表达和乱序的适配体修饰。
[0016]还包括步骤S7，结果的判断，通过免疫信号与内标信号的比值来定性识别出新型冠状病毒。
[0017]其中，内标信号/免疫信号比值范围为1
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∞则新型冠状病毒空白；内标信号/免疫信号比值范围为0
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1则新型冠状病毒阳性。
[0018]本专利技术中的乱序适配体是无法识别新型冠状病毒的序列。
[0019]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤S1、S3、S4中核酸适配体为新型冠状病毒表面刺突蛋白的核酸适配体。
[0020]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸适配体生物素标记为末端修饰生物素标记。
[0021]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤S1具体包括：取修饰了链霉亲和素的磁珠，加入洗涤缓冲液；将上述磁珠在缓冲液重悬，加入生物素化适配体，在室温下孵育，并用缓冲液洗涤，重悬于PBS溶液中，加入封闭剂，封闭磁珠表面的剩余结合位点，磁分离，并用PBS溶液洗涤，最后重新分散在PBS溶液中，制得所述的免疫磁珠捕获纳米粒子。
[0022]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤S1中磁珠的粒径为1
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5μm，更优选为1
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2μm。
[0023]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述缓冲液为B&W洗涤缓冲液，其组成包括pH 4
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8的1
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50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)
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HCl、1
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10mM EDTA和2
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10mM NaCl。
[0024]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述封闭剂为TBS溶液，即Super block blocking buffer溶液。
[0025]在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤S1中将磁珠与生物素化适配体混合，室温下孵育5
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30min。
[0026]在本专利技术的一个优选实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：制备免疫磁珠捕获纳米粒子：将新型冠状病毒抗原的核酸适配体修饰在已经修饰了链霉亲和素的磁性微球上，以形成免疫磁珠捕获纳米粒子；S2：制备金属纳米粒子；S3：制备免疫金属信号纳米粒子：将步骤S2制备的金属纳米粒子与拉曼信号分子和巯基修饰的新型冠状病毒抗原的核酸适配体进行混合，并封闭活性位点，获得免疫金属信号纳米粒子；S4：制备内标金属信号纳米粒子：将步骤S2制备的金属纳米粒子与内标信号分子和巯基修饰的乱序核酸适配体进行混合，并封闭活性位点，获得内标金属信号纳米粒子；S5:三明治结构的制备：将步骤S1制得的免疫磁珠捕获纳米粒子、待测样、步骤S3制得的免疫金属信号纳米粒子和步骤S4制得的内标金属信号纳米粒子一起混合、孵育后进行磁吸分离，获得含内标的三明治结构；S6：SARS
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CoV
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2病毒的检测：将步骤S5获得的含内标的三明治结构进行拉曼检测，得到新型冠状病毒抗原的拉曼光谱结果。2.如权利要求1所述的一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法，其特征在于，还包括步骤S7，结果的判断，通过免疫信号与内标信号的比值来定性识别出新型冠状病毒。3.如权利要求1所述的一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法，其特征在于，所述步骤S1、S3、S4中核酸适配体为新型冠状病毒表面刺突蛋白的核酸适配体，核酸适配体生物素标记为末端修饰生物素标记。4.如权利要求1所述的一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括取100
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1000ul浓度为1
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10ug/ul的修饰了链霉亲和素的磁珠，加入B&W洗涤缓冲液，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，磁吸弃去上清液；将上述磁珠在B&W洗涤缓冲液重悬至最终浓度的一半，加入10
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200ul 100uM生物素化适配体，在室温下孵育5
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30min，磁吸弃去上清液，并用洗涤缓冲液洗涤，重悬于PBS溶液中，然后加入100
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3000ul封闭剂，室温下反应1
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5h封闭磁珠表面的剩余结合位点，磁分离，并用PBS溶液洗涤，最后重新分散在PBS溶液中，制得所述的免疫磁珠捕获纳米粒子。5.如权利要求4所述的一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法，其特征在于，所述磁珠的粒径为1
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5μm；所述缓冲液为B&W洗涤缓冲液，其组成包括pH 4
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8的1
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50mM Tris
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HCl、1
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10mM EDTA和2
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10mM NaCl；所述封闭剂为质量分数为1％
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25％的BSA溶液。6.如权利要求1所述的一种基于内标法的SARS
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CoV
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2表面抗原SERS检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的核酸适配体为5
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biotin
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ATCCAGAGTGACGCAGCATTTCATCGGGTCCAAAAGGGGCTGCTCGGGATTGCGGATATGGACACGT
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3、5
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biotin
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CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA
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3、5
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【专利技术属性】
技术研发人员：李剑锋，许珊珊，张月皎，陈泽辉，
申请(专利权)人：嘉庚创新实验室厦门市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：