基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法、试剂及应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法、试剂及应用，从胃癌外周血液样本中分离PBMCs；向PBMCs中分别加入Easy Buffer，再加入FcR blocker；利用CD45试剂盒去除CD45+的免疫细胞；使用CSV抗体对细胞进行标记，进行CSV+CTC阳性筛选；加入鼠抗磁珠，通过LS磁柱筛选，获得CD45

【技术实现步骤摘要】
基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法、试剂及应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法、试剂及应用。

技术介绍

[0002]胃癌的早期症状不明显，多数胃癌患者诊断时已出现转移，失去手术根治的机会。尽管靶向和免疫治疗等综合治疗模式的应用有效延长转移性胃癌患者生存期，但五年总生存率仍低于30％，不断激增的胃癌“双率”令人担忧。多年来，针对胃癌发生发展的分子生物学机理进行了较为广泛的研究，但胃癌转移机制至今仍是亟待解决的世界性难题。因此，积极探索胃癌转移分子机制，筛选有效预测胃癌转移风险的生物标志物和潜在药物新靶点，有望为胃癌精准治疗带来新的突破。
[0003]在肿瘤转移的过程中，大部分脱落的肿瘤细胞进入外周循环系统，成为痕量的循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)，开启肿瘤转移途径。进入血液中的CTCs要经受住物理性和生物性的重重考验，才能存活下来并真正成为转移的“始作俑者”。为了维持生存，CTCs细胞会“乔装打扮”一番，通过丢失某些上皮细胞表型(包括形态、表面抗原等)，获得间质细胞特征，即发生上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)，粘附在内皮组织进行侵袭和肿瘤转移。最新研究报告，EMT
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CTCs细胞为了获得更强的运动性和侵袭性，会将细胞浆内的波形蛋白(vimentin)募集到细胞表面，变成细胞膜表面波形蛋白(Cell surface vimentin,CSV)，而这部分CSV阳性的肿瘤细胞更容易突破血管内皮和基底膜，定植形成远处转移灶，成为导致肿瘤转移的“静默杀手”。因此，CSV+CTCs很可能是引致胃癌转移的特殊CTCs亚群。如能在胃癌患者治疗过程中，及时富集和消灭这种诱导胃癌转移的“元凶”，将为阻断胃癌转移并延长患者远期生存起着至关重要的作用。然而此时，如何精准分离和捕获这种特殊CTCs亚群成为制约这一关键科学问题的“卡脖子”技术。
[0004]目前现有的CTCs检测技术基础是基于美国强生公司的CellSearch检测技术，由美国强生公司开发。它是全球第一个经过FDA(2004年获批)和CFDA(2012年获批)批准用于恶性肿瘤疾病管理的检测循环肿瘤细胞的商业化产品。CellSearch自2013年正式在华销售，到2015年底，三年内销售上百台，该系统销售单价约400万元。而系统引进医院的实际检测量却不尽如人意。CellSearch系统技术上的缺陷，是造成其被市场边缘化的主要因素：
[0005]1、循环肿瘤细胞有数十种分子分型，CellSearch只能检测到其中一个分子分型，漏检率很高。
[0006]2、无法实现活细胞捕获。死细胞可以做DNA测序但不能做RNA测序也不能做用药指导，所以只能实现计数功能。
[0007]3、至于将找到的CTCs单个细胞分离出来，需要使用超显微仪器进行切割。超显微是一种特殊的仪器，价格约200万元，对于普通的基层医院很难满足需求。
[0008]4、即便是使用了超显微手段将CTCs单个细胞切割出来，但切割出的单细胞也无法
保持活性，而且不能保证足够的数量和完整性。而且不是一次性检测，是动态检测，需要多次检测比对结果，一位患者至少要检测三四次。
[0009]5、在进行荧光显微镜读数时候，普通的荧光显微镜是需要依靠医生人工识别来统计细胞数量、判断阳性和阴性等信息，该判读方法效率较低，且容易产生遗漏或记错数的情况，因此过程中会掺杂很多的主观因素，得到的结果甚至会因人而异。此外，普通显微成像需要医生在屏幕和显微镜之间反复的切换，会使得整个过程更加耗时耗力。如若是标记大于三种颜色的荧光显色剂，图像中的噪声(即非真实的信号)会随着标记颜色种类的增多而增加，甚至会导致图像中有较强的颗粒感，这会直接影响医生对结果的正确判读。
[0010]综上所述，CellSearch不仅抗体捕获方式局限性大，而且无法实现活细胞捕获并进行后续基因检测以及用药指导。目前肿瘤患者的基因检测标本的主要来源是肿瘤手术病理切片或活检样本，但是这些样本获取困难，不仅对肿瘤患者有侵入性还有一定的风险，而且活检病理难以动态跟踪疾病进程。因此液体活检特别是CTCs被认为是最可靠的个体化诊疗标本来源，探索更加精准的CTCs检测技术是目前以晚期胃癌为代表的恶性肿瘤精准诊疗的重中之重。

技术实现思路

[0011]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法、试剂及应用。
[0012]本专利技术是这样实现的，首先提供一种基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：
[0013]1)从外周血液样本中分离PBMCs；
[0014]2)向PBMCs中分别加入Easy Buffer，再加入FcR blocker；
[0015]3)利用CD45试剂盒去除CD45+的免疫细胞，留下CD45
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的细胞；
[0016]4)使用CSV抗体对细胞进行标记，进行CSV+CTC阳性筛选；
[0017]5)加入鼠抗磁珠，通过LS磁柱筛选，获得CD45
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CSV+CTC，用荧光显微镜计数并拍摄图像。
[0018]优选的，上述方法还包括如下步骤：
[0019]6)使用数字图像增强方法对步骤5)中拍摄的图像进行预处理，使用深度学习方法搭建图像分割模型，对图像中的所有细胞进行像素级的语义分割，最后将分割模型输出的分割标签使用数字图像处理方法对连通域进行计数，为了处理细胞粘连的情况，在计数前使用分水岭算法将粘连的细胞分离开，确保计数正确。
[0020]本专利技术还提供一种基于CSV检测循环肿瘤细胞的试剂，所述试剂含有CSV抗体，且所述试剂用于检测循环肿瘤细胞。
[0021]本专利技术还提供一种CSV的新应用，所述CSV作为标记物，用于检测循环肿瘤细胞。
[0022]优选的，上述CSV为CSV
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84
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1。
[0023]优选的，所述肿瘤细胞为胃癌肿瘤细胞。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0025]本专利技术采用纯化的CSV特异性单克隆抗体84
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1，同时融合阴性富集法和阳性富集法筛选技术，实现针对多种晚期实体肿瘤CTCs的精准检测，通过进一步优化冻存血方法，首
次突破经冻存血单个核细胞PBMC提取外周血CTCs的技术瓶颈。基于该项技术，本专利技术同期开展了一系列转化研究，在非小细胞肺癌、鼻咽癌等实体肿瘤中证实该技术可以弥补CellSearch CTCs检测的弊端，显著提升CTCs检出的敏感度和特异度。本专利技术建立的这种可以实施实时、无创、精准且操作方便的CTCs监测技术，成功在具有高度异质性的晚期肿瘤患者外周血中富集CTCs，并结合已构建的细胞和动物模型，对复发转移分子机制以及筛选潜在的可以协同增敏的靶向药物进行深入研究，是研究实体肿瘤复发转移分子机本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)从外周血液样本中分离PBMCs；2)向PBMCs中分别加入Easy Buffer，再加入FcR blocker；3)利用CD45试剂盒去除CD45+的免疫细胞，留下CD45
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的细胞；4)使用CSV抗体对细胞进行标记，进行CSV+CTC阳性筛选；5)加入鼠抗磁珠，通过LS磁柱筛选，获得CD45
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CSV+CTC，用荧光显微镜计数并拍摄图像。2.根据权利要求1所述的基于CSV检测循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，还包括如下步骤：6)使用数字图像增强方法对步骤5)中拍摄的图像进行预处理，使用深...

【专利技术属性】
技术研发人员：李贺明，韩涛，代茵，徐子安，李克蕊，胡其霖，尹畅，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：