一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒，包括偶联磁珠组、检测抗体和报告分子；所述的偶联磁珠组分别由检测犬细小病毒的磁珠CPV

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及宠物病毒病检测
，尤其是一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]犬细小病毒病(Canine parvovirus disease)是由犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)引起的犬的一种急性传染病，该病在临床上主要表现为发热、呕吐、出血性肠炎、白细胞减少和幼犬心肌炎。目前免疫接种是防治该病的主要措施。犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine Distemper virus,CDV)感染引起的急性、高度接触性传染疾病，以双向热型、结膜炎、肺炎、肠炎和神经症状为临床症状，死亡率高。由于高水平母源抗体的干扰或疫苗抗原性差异，往往导致免疫失败而引起犬瘟热的发生。犬疱疹病毒病毒病是由犬疱疹病毒(Canineherpesvirus,CHV)感染引起的新生幼犬致死性感染的一种疾病。21日龄以上的幼犬主要表现为上呼吸道症状，流鼻涕、咳嗽和打喷嚏等；同时可造成母犬不孕、流产和死胎以及公犬的阴茎炎和包皮炎。
[0003]近年来，由于疫苗抗原性差异，幼犬母源抗体干扰，免疫犬抗体水平过低导致免疫失败，引发CPV和CDV感染的报道不断出现。因此及时了解幼犬CPV、CDV母源抗体水平和免疫犬抗体水平，确定最佳的疫苗免疫时机，对于CPV和CDV的防控具有重要意义。
[0004]通过检测母源抗体及接种后抗体的水平，确定其是否达到预期的保护性抗体滴度，从而确定疫苗的最适接种时间。目前能够检测犬血清抗体水平的技术主要有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、血凝抑制试验等方法。血清中和试验是检测血清中和抗体的标准方法，也常用来评价疫苗免疫效果的好坏。虽然血清中和试验灵敏特异，但花费时间较长。另外对试验操作人员要求水平较高，需要熟练掌握细胞接毒后细胞的病变现象，不利于快速检测血清抗体。酶联免疫吸附试验(ELISA)是免疫学检测技术中广泛应用于血清抗体检测的一项技术，它是将抗原或者抗体吸附在固相载体上，借助于抗原
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抗体反应实现检测目的。但由于ELISA方法检测成本高以及需要特殊的仪器，需专业技术人员操作，导致这些检测只能局限于实验室或相应的宠物诊疗机构。血凝抑制试验(HI)被广泛用于定量检测CPV特异性抗体，是CPV抗体检测的金标准。但HI检测结果容易受检测者主观影响，且检测需要猪新鲜的红细胞和完整且大量的病毒粒子，在操作时容易受一些非特异性抑制剂的影响。
[0005]这些方法有一个共同的缺点：一次试验只能检测一种病原抗体水平，无法通过灵活地组合实现对多种病原抗体高通量、多通道的高效检测。因此这些技术方法都不适用于动物群体性疾病的实时检测。液相芯片是一种新型生物芯片技术平台，具有操作简便，敏感性强，灵活多变、检测范围广等显著特点，其最大的优势是可以同时对同一血清样品中多种病原抗体进行定性分析，实现多种病原抗体的实时监测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试
剂盒及方法，本专利技术能够满足快速、准确、高通量的宠物疫病抗体监测要求。
[0007]本专利技术的技术方案为：一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒，包括偶联磁珠组、检测抗体和报告分子；
[0008]所述的偶联磁珠组分别由检测犬细小病毒的磁珠CPV
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35、检测犬瘟病毒的磁珠CDV
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45，检测犬疱疹病毒的磁珠CHV
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43组成；
[0009]所述的磁珠CPV
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35是CPV VP1重组蛋白与第35号磁珠偶联获得；
[0010]所述的磁珠CDV
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45是CDV天然抗原与第45号磁珠偶联获得；
[0011]所述的磁珠CHV
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43是CHV天然抗原与第43号磁珠偶联获得。
[0012]作为优选的，所述检测抗体为生物素标记的抗犬IgG抗体。
[0013]作为优选的，所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素。
[0014]作为优选的，所述荧光蛋白或荧光素选自藻红蛋白、Cy3、Cy5中的一种。
[0015]作为优选的，所述偶联磁珠的制备方法为：
[0016]将3种不同编号(35#、45#、43#)的空白磁珠活化后，用偶联缓冲液重悬并分散磁珠，分别加入CPV VP2重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液混匀后室温避光下进行偶联反应2小时，离心去上清，获得3种包被不同抗原的磁珠，即偶联磁珠。
[0017]作为优选的，所述的偶联缓冲液为50～100mM乙磺酸(MES)，pH 5.0～6.0。
[0018]作为优选的，所使用的CPV VP2重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液的浓度为0.3～3mg/mL。
[0019]作为优选的，所述空白磁珠活化步骤包括以下步骤：
[0020](1)、磁珠预处理：取3种不同编号(35#、45#、43#)的空白磁珠，离心弃上清，用活化缓冲液重悬磁珠，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，离心后弃上清。
[0021](2)、磁珠的活化：将预处理的磁珠分别用活化缓冲液重悬，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，再依次加入N
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羟基磺基琥珀酰亚胺溶液(Sulfo
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NHS)和碳二亚胺溶液(EDC)，混匀后，室温避光作用20min，以得到活化磁珠。
[0022]作为优选的，所述活化缓冲液为100mM NaH2PO4，pH 6.2。
[0023]作为优选的，本专利技术还提供一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的方法，采用上述液相芯片试剂盒进行检测，具体包括如下步骤：
[0024]S1)、偶联磁珠与样品中的抗体结合：将偶联磁珠与预处理的待测样品于室温、避光条件下震荡孵育1～2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；
[0025]S2)、加入检测抗体及反应：将生物素标记的抗犬IgG抗体加入至上一步反应体系中，于室温、避光条件下震荡孵育30～60min，用洗涤缓冲液洗涤3次；
[0026]S3)、结果检测：将报告分子加入到上步反应体系中，于室温、避光条件下震荡孵育30～60min，用洗涤缓冲液洗涤3次；
[0027]S4)、结果检测：往反应体系中加入洗涤缓冲液，室温、避光条件下震荡60s，置于Luminex 200液相芯片系统读取荧光强度。
[0028]S5)、结果分析：先计算阴性对照血清的平均荧光强度值和标准差，以阴性血清的平均荧光强度值与3倍标准差的和作为临界值，高于临界值视为阳性。
[0029]作为优选的，步骤S1)中，所述待测样品为血清样品，待测样品预处理包括将待测样品进行1：10～50倍稀释、过滤。
[0030]作为优选的，步骤S1)中，所述偶联磁珠与预处理后的待测样品的体积比为1：(0.8～1.2)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒，其特征在于：包括偶联磁珠组、检测抗体和报告分子；所述的偶联磁珠组分别由检测犬细小病毒的磁珠CPV
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35、检测犬瘟病毒的磁珠CDV
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45，检测犬疱疹病毒的磁珠CHV
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43组成；所述的磁珠CPV
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35是CPV VP1重组蛋白与第35号磁珠偶联获得；所述的磁珠CDV
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45是CDV天然抗原与第45号磁珠偶联获得；所述的磁珠CHV
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43是CHV天然抗原与第43号磁珠偶联获得。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述检测抗体为生物素标记的抗犬IgG抗体。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素；所述荧光蛋白或荧光素选自藻红蛋白、Cy3、Cy5中的一种。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的偶联磁珠的制备方法为：将3种不同编号的空白磁珠活化后，用偶联缓冲液重悬并分散磁珠，分别加入CPV VP1重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液，混匀后室温避光条件下进行偶联反应2小时，离心去上清，获得3种包被不同抗原的磁珠，即偶联磁珠。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的偶联缓冲液为50～100mM乙磺酸MES，pH 5.0～6.0。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所使用的CPV VP1重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液的浓度为0.3～3mg/mL。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的空白磁珠活化步骤如下：(1)、磁珠预处理：取3种不同编号的空白磁珠，离心弃上清，用活化缓冲液重悬磁珠，涡旋10s，再超声10s以打散磁珠，离心后弃上清；(2)、磁珠的活化：将预处理的磁珠分别用活化缓冲液重悬，涡旋10s，再超...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈桂华，伍绮文，郭鹏举，
申请(专利权)人：广东宠健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：