一种通过超分辨荧光显微镜对细胞表面MMP14成像诊断乳腺细胞迁移性的方法技术

本发明专利技术公开了一种诊断乳腺细胞迁移性的方法，步骤为：对细胞膜表面的MMP14进行荧光成像，通过统计分析细胞膜表面的MMP14蛋白定位点数量与聚集性参数进行分析达到诊断乳腺细胞迁移性强弱的目的。本方法通过纳米级的分辨率测量细胞表面MMP14的分布聚集情况，推测细胞迁移可能性，对样品细胞的损伤少，实验流程时间成本小，在医学诊断领域具有广泛的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种通过超分辨荧光显微镜对细胞表面MMP14成像诊断乳腺细胞迁移性的方法


[0001]本专利技术涉及一种诊断乳腺细胞迁移性的方法，更具体地讲，本专利技术涉及一种基于超分辨荧光成像低时间成本准确诊断乳腺细胞迁移性的方法。

技术介绍

[0002]目前，癌症已成为全世界的一个主要公共卫生问题，乳腺癌死亡率在女性恶性肿瘤中居首位，发病率每年不断上升，因此了解癌细胞转化和肿瘤进展的功能机制非常重要。癌细胞的转移是肿瘤进展的最后一步，也是癌症死亡率的主要原因，转移过程中组织细胞必须降解和重建周围的细胞外基质，以执行迁移和细胞形状变化等细胞功能。基质金属蛋白酶
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14(MMP14)作为一种跨膜蛋白水解酶，参与降解细胞外基质，被认为是癌症进展和转移的关键介质。目前，关于MMP14的研究大多都集中在相关基因与蛋白的表达改变对组织生物学性能产生的影响，但是对于分析MMP14膜蛋白预测具体癌症发生迁移的可能性存在一些空白。
[0003]最广泛应用的鉴定细胞迁移性的方法是划痕实验技术。这种实验方法通过在铺满细胞的培养皿中人为的制造划痕，然后使用无血清培养基继续培养一些时间后拍照，最后使用Image J统计得到迁移细胞速度。但这种鉴定方法存在许多严重的缺点，如细胞长时间在无血清培养基中培养，细胞凋亡速率会增加，而肿瘤细胞系在无血清培养基中的凋亡率常常高于非肿瘤细胞系，这会对统计结果造成较大的误差；且仅适用于贴壁细胞，无法完成对悬浮细胞的检测；其实验流程常超过24h以上，具有较大的时间成本；另外，细胞整体生理活动可能会随血清浓度的减少发生改变。目前，也有许多研究人员利用癌症相关的肿瘤标志物，通过检测免疫荧光诊断和评估，但在这些已报道的方法中，受限于传统光学显微镜的分辨率影响，因此难以获得肿瘤标志物的空间组装细节信息，需要更加精细的手段进行细胞迁移可能性的诊断。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术提出一种基于超分辨荧光显微镜，对细胞膜表面MMP14蛋白进行单分子定位分析的方法鉴定乳腺细胞迁移性。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种通过超分辨荧光显微镜对细胞表面MMP14成像诊断乳腺细胞迁移性的方法，其特征在于：步骤如下：
[0007](1)用4％多聚甲醛(PFA)室温固定汇合度～60％的细胞20min，PBS洗涤3次。
[0008](2)用3％的BSA封闭20min。
[0009](3)去除封闭缓冲液后，细胞用Cy5偶联的MMP14适配体在4℃下染色10min。
[0010](4)去除染色液MMP14
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抗体，用PBS洗涤样品5次，用于dSTORM成像实验。
[0011](5)使用倒置荧光显微镜和油浸物镜，样品用639nm激光器激发，通过结合ImageJ
软件，对目标成像获得5000个原始帧。
[0012](6)对原始数据进行ThunderSTORM分析，重建得到ThunderSTORM图像，获得每一个单分子的定位信息。
[0013](7)通过定位信息计算单位面积下MMP14蛋白的分布数量，并将每一个单分子的定位坐标导入SR
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Tesseler来分析MMP14的聚集情况。
[0014]本专利技术基于打破光学衍射极限的超分辨荧光显微镜，使得横轴分辨率可以达到数十纳米，能够获得亚细胞结构肿瘤标志物MMP14细胞膜蛋白的单分子详细定位信息，从而为解决传统诊断问题提供了非常合适的工具。
[0015]本专利技术与现有技术相比，对样品伤害小，对细胞自身生理活动的改变较小的测算细胞迁移可能性，具有较小的时间成本，能够快速完成分析过程；由于膜蛋白具有较小的自身尺寸，超分辨荧光显微镜具有较高的空间分辨率，且对样本的伤害较小。本专利技术具有结果可靠性高、所需时间少、结果准确性高等优点。
附图说明
[0016]图1为药物处理后的MDA
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231基底膜上MMP14的dSTORM比较成像。(A
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C)正常MDA
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231(A)，经ACM(B)或DKK
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1处理(C)后，基底膜上MMP14分布的重建dSTORM图像。(D
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F)通过SR
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Tesseler分析识别出的合格蛋白簇的相应图像。(G
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I)比较了正常、ACM处理和DKK
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1处理的MDA
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231细胞中MMP14的点密度(G)、平均簇面积(H)的直方图。
[0017]图2为乳腺癌细胞MDA
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231和正常乳腺细胞MCF10A上MMP14的对比dSTORM成像。(A，B)MDA
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231(A)和MCF10A(B)基底膜上MMP14的重建dSTORM图像。(C，D)通过SR
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Tesseler分析识别的合格蛋白簇的对应图像。(E
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G)比较MDA
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231(黑色)和MCF10A(灰色)上点密度(E)、簇面积(F)的直方图。
具体实施方式
[0018]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明：
[0019]实施例1：对人乳腺癌细胞MDA
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231细胞进行超分辨成像：
[0020]用4％多聚甲醛室温固定汇合度～60％高迁移性的人乳腺癌细胞MDA
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231细胞20min，PBS洗涤3次。用3％的BSA封闭细胞20min。去除封闭缓冲液后，细胞用Cy5偶联的MMP14适配体在4℃下染色20min。去除染色液MMP14
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适配体，用PBS洗涤样品5次，使用倒置荧光显微镜和油浸物镜，样品用532nm激光器激发，通过结合ImageJ软件，对目标成像获得5000个原始帧。对原始数据进行ThunderSTORM分析，重建得到ThunderSTORM图像，获得每一个单分子的定位信息。通过定位信息计算单位面积下MMP14蛋白的分布数量，将定位点坐标导入SR
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Tesseler软件计算其成簇面积。
[0021]检测：以人乳腺癌细胞MDA
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231细胞为对象，利用超分辨荧光显微镜对实施例1实验后的MMP14荧光定位点进行分析，结果表明，迁移性较高的人乳腺癌细胞MDA
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231细胞基底膜上的MMP14平均定位点密度较多，进行定量分析后结果为1399.51N/μm2，平均簇面积为0.086μm2，具体结果见图1。
[0022]实施例2：对人乳腺癌细胞MDA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过超分辨荧光显微镜对细胞表面MMP14成像诊断乳腺细胞迁移性的方法，其特征在于：步骤如下：(1)用4％多聚甲醛(PFA)室温固定汇合度～60％的细胞20min，PBS洗涤3次。(2)用3％的BSA封闭20min。(3)去除封闭缓冲液后，细胞用Cy5偶联的MMP14适配体在4℃下染色10min。(4)去除染色液MMP14
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抗体，用PBS洗涤样品5次，用于dSTORM成像实验。(...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛典，陈俊玲，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：