羧酸还原酶突变体及其在合成氨基脂肪酸中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种羧酸还原酶突变体，编码所述羧酸还原酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，突变体酶催化剂的制备，以及突变体酶催化剂在合成氨基脂肪酸中的应用。与其他制备中长链氨基脂肪酸的生物催化剂相比，本发明专利技术提供的羧酸还原酶突变体具有底物谱广、催化活性高和底物特异性强等优点，在工业应用中显示出广泛的应用前景。在工业应用中显示出广泛的应用前景。在工业应用中显示出广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
羧酸还原酶突变体及其在合成氨基脂肪酸中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种羧酸还原酶突变体，编码所述羧酸还原酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，突变体酶催化剂的制备，以及突变体酶催化剂在合成氨基脂肪酸中的应用。

技术介绍

[0002]尼龙广泛应用于纺织业、汽车工业、电子电器工业、机械设备、建筑业等，其中尼龙6在尼龙中所占比例较大。6
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氨基己酸(6
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Aminohexanoic acid,6
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ACA)是尼龙6(全球每年产量近700万吨)的单体，市场需求巨大。目前主要是通过化学法合成，但是化学合成法普遍存在反应条件苛刻、催化剂昂贵和环境污染大等缺点。为了响应国家对绿水青山和绿色生物制造的号召，选择具有良好催化性能、反应条件温和的酶催化剂用于合成6
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氨基己酸是一种非常有潜力的合成路线。
[0003]目前已报道多种不同的生物酶法途径用于合成6
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氨基己酸。早在2014年，Sattler等以环己醇(50mM)作为出发底物，在只消耗氧气和氨气的条件下，通过多酶级联催化合成6
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氨基己酸(Angewandte Chemie,2014,126(51):14377
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14381)，但是最终产率只有24％。随后在2018年，韩国建国大学Hyungdon Yun等以6
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羟基脂肪酸为底物，利用醛还原酶和转氨酶级联催化合成6
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氨基己酸，产率最高达到96.7％，但是该路线的底物依然较昂贵(Green Chemistry,2018,20(20):4591
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4595)。2020年，Fedorchuk等以己二酸为底物，利用羧酸还原酶(CARs)和转氨酶(ω
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TAs)将己二酸转化为6
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氨基己酸(Journal of the American Chemical Society,2019,142(2):1038
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1048)，但是该级联反应过程中底物浓度只有10mM，同时由于羧酸还原酶的底物特异性差，导致产物被进一步转化为6
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氧代己胺，因此6
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氨基己酸的得率低。综上，亟需获得一个对底物己二酸转化效率高，底物特异性强的羧酸还原酶用于高效合成6
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氨基己酸等中长链氨基脂肪酸。

技术实现思路

[0004]针对目前生物催化转化二元羧酸合成中长链氨基脂肪酸(C6
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C12)体系中羧酸还原酶催化活性低、底物特异性差等问题，本专利技术提供了一种来源于Kibdelosporangium sp.MJ126
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NF4的羧酸还原酶(NCBI Reference Sequence:WP_198151610.1)及其突变体基因，该酶的氨基酸序列和来源于Mycobacterium abscessus的羧酸还原酶MabCAR同源性仅为53.8％，并提供含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，所述羧酸还原酶突变体、可表达该羧酸还原酶突变体的重组转化体培养物的制备方法，以及该羧酸还原酶突变体或重组转化体培养物在催化二元羧酸合成中长链氨基脂肪酸中的应用。
[0005]与其它羧酸还原酶相比，本专利技术提供的羧酸还原酶突变体具备更高的催化效率和对底物二元羧酸的底物特异性，从而具备更优良的中长链氨基脂肪酸合成效果。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术的技术方案之一是：
[0008]提供一种羧酸还原酶突变体，即提供一种分离的蛋白质，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第276位Ile、第299位Gly、第335位Leu、第386位Thr、第411位Gly中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质。所述突变体蛋白质对α,ω
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二元羧酸活性显著提升，在底物特异性方面也有所提高。
[0009]具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质命名为KiCAR。编码KiCAR的核酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0010]优选地，羧酸还原酶突变体的氨基酸序列为如下中的一种：
[0011](1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第276位异亮氨酸Ile替换为脯氨酸Pro；
[0012](2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第276位异亮氨酸Ile替换为精氨酸Arg；
[0013](3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第299位甘氨酸Gly替换为异亮氨酸Ile；
[0014](4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第299位甘氨酸Gly替换为赖氨酸Lys；
[0015](5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第299位甘氨酸Gly替换为精氨酸Arg；
[0016](6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第335位亮氨酸Leu替换为赖氨酸Lys；
[0017](7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第335位亮氨酸Leu替换为精氨酸Arg；
[0018](8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第386位苏氨酸Thr替换为赖氨酸Lys；
[0019](9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第386位苏氨酸Thr替换为精氨酸Arg；
[0020](10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为丙氨酸Ala；
[0021](11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为精氨酸Arg；
[0022](12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为赖氨酸Lys；
[0023](13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为谷氨酸Glu；
[0024]本专利技术的技术方案之二是：提供编码所述羧酸还原酶突变体的核酸。
[0025]所述核酸编码如技术方案之一所述羧酸还原酶突变体中的任意一个。
[0026]所述编码羧酸还原酶突变体的核苷酸序列为编码如技术方案之一所述羧酸还原酶突变体的核酸序列。
[0027]本专利技术的技术方案之三是：提供一种重组表达载体。
[0028]所述重组表达载体包含如技术方案之二所述的核酸。
[0029]所述重组表达载体可以通过本领域常规方法，将本专利技术所述的羧酸还原酶突变体的编码核酸序列连接于pET30b质粒。
[0030]进一步地，为了使羧酸还原酶突变体成功表达，并表现出催化活性，需要将来源于Bacilus subtilis的磷酸泛酰乙炔基修饰酶Bssfp(NCBI Reference Sequence:WP_0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羧酸还原酶突变体，其特征在于，为如下中的一种：(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第276位异亮氨酸Ile替换为脯氨酸Pro；(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第276位异亮氨酸Ile替换为精氨酸Arg；(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第299位甘氨酸Gly替换为异亮氨酸Ile；(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第299位甘氨酸Gly替换为赖氨酸Lys；(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第299位甘氨酸Gly替换为精氨酸Arg；(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第335位亮氨酸Leu替换为赖氨酸Lys；(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第335位亮氨酸Leu替换为精氨酸Arg；(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第386位苏氨酸Thr替换为赖氨酸Lys；(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第386位苏氨酸Thr替换为精氨酸Arg；(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为丙氨酸Ala；(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为精氨酸Arg；(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为赖氨酸Lys；(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第411位甘氨酸Gly替换为谷氨酸Glu。2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述羧酸还原酶突变体。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2所述核酸。4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。5.一种重组羧酸还原酶突变体催化剂，其特征在于，所述重组羧酸还原酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：(1)培养权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁惠蕾，李举谋，张志钧，石焜，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：