一种脱氢酶突变体及利用其制备甲泼尼龙脱氢物的方法技术

本发明专利技术公开了一种脱氢酶突变体及利用其制备甲泼尼龙脱氢物的方法。所述脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述脱氢酶突变体为在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：第315位、第330位或第452

【技术实现步骤摘要】
一种脱氢酶突变体及利用其制备甲泼尼龙脱氢物的方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，涉及一种脱氢酶突变体及利用其制备甲泼尼龙脱氢物的方法。

技术介绍

[0002]甲泼尼龙(如式I所示)是一种皮质激素类药物，具有较强的抗炎作用，其抗炎作用为可的松的7倍。用于危重疾病的急救，还可用于内分泌失调、风湿性疾病、胶原性病、皮肤疾病、过敏反应、眼科疾病、胃肠道疾病、血液疾病、白血病、休克、脑水肿、多发性神经炎、脊髓炎及防止癌症化疗引起的呕吐等。目前临床上主要用于脏器移植。
[0003][0004]以往的甾体C1，2脱氢化学生产是采用SeO2脱氢，但是SeO2是剧毒物质，且转化率很低。后来逐渐被生物法所代替，如利用简单节杆菌、分枝杆菌及简单诺卡氏菌等，利用细胞发酵进行C1，2位脱氢反应。如专利《6
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α甲基泼尼松龙中间体的生物脱氢制备方法》(参见CN101760495A)，《一种甲基泼尼松龙脱氢物的生产方法》(参见CN112608970A)等采用细胞发酵的方法生产甲泼尼龙脱氢物。但是细胞发酵周期较长，发酵时间一般在2～3天左右，前期种子液的培养以及培养基的配置和灭菌过程繁琐，且发酵过程的需严格控制发酵参数及染菌情况。
[0005]目前亟需转化率高且生产流程简易的制备甲泼尼龙脱氢物的方法。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中缺乏转化率高且生产流程简易的制备甲泼尼龙脱氢物的方法的问题，本专利技术提供了一种脱氢酶突变体及其应用，及利用其制备甲泼尼龙脱氢物的方法，其制备过程如式II所示：
[0007][0008]本专利技术提供的利用所述脱氢酶突变体制备甲泼尼龙脱氢物的方法，相较于传统细胞发酵方法，转化率高且生产流程简易。
[0009]本专利技术第一方面提供了一种脱氢酶突变体，所述脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述脱氢酶突变体为在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：
[0010]第315位、第330位或第452
‑
463位。
[0011]本专利技术一些实施方案中，所述脱氢酶突变体在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：
[0012]所述第315位的氨基酸残基由F突变为A、G、V或S，所述第330位的氨基酸序列残基由L突变为A、G、V或S，和/或删去所述第452位
‑
第463位的氨基酸残基。
[0013]本专利技术一些实施方案中，所述脱氢酶突变体序列为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。
[0014]本专利技术一些具体的实施方案中，所述脱氢酶突变体序列为SEQ ID NO：5。
[0015]本专利技术第二方面提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码如第一方面所述的脱氢酶突变体。
[0016]本专利技术第三方面提供了一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包含如第二方面所述的核酸。
[0017]本专利技术一些实施方案中，所述重组表达载体的骨架质粒为pET26b(+)或pET28a(+)。
[0018]本专利技术第四方面提供了一种转化体，其中所述转化体包含如第三方面所述的重组表达载体。
[0019]本专利技术一些实施方案中，所述转化体的底盘菌为大肠杆菌，例如大肠杆菌BL21(DE3)。
[0020]本专利技术第五方面提供了一种制备如第一方面所述的脱氢酶突变体的方法，所述方法包括将所述转化体在适合的培养基中生长，以产生所述脱氢酶突变体。
[0021]本专利技术一些实施方案中，所述方法包括：
[0022](1)将包含如第四方面所述的转化体的种子液接种至LB液体培养基中，37℃震荡培养；
[0023](2)OD
600
约为0.6
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0.8时添加IPTG；
[0024](3)25℃震荡培养；
[0025](4)收集、破碎菌体；
[0026](5)收集上清液，即得。
[0027]本专利技术一些实施方案中，所述方法中：
[0028](1)所述转化体的接种量为1％；
[0029](2)所述IPTG的终浓度为0.1
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0.2mM；
[0030](3)震荡培养18
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24小时；
[0031](4)离心收集菌体，使用PBS重悬菌体，pH为7
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7.5。
[0032]本专利技术第六方面提供了一种制备甲泼尼龙脱氢物的方法，所述方法利用如第一方面所述的脱氢酶突变体制备甲泼尼龙脱氢物。
[0033]本专利技术一些实施方案中，所述方法包括以下一种或多种步骤：
[0034](1)将包含所述脱氢酶突变体的酶液或纯酶与甲泼尼龙格氏物混合；
[0035](2)pH 7.5，35℃中反应，并搅拌。
[0036]本专利技术一些实施方案中，所述方法包括加入助溶剂使甲泼尼龙格氏物增溶，其中所述助溶剂选自DMSO、Triton
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X100、吐温80和/或PEG
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200中的一种或多种。
[0037]本专利技术一些具体的实施方案中，所述助溶剂为Triton
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X100和/或DMSO。
[0038]本专利技术第七方面提供了第一方面所述的脱氢酶突变体在制备甲泼尼龙脱氢物中的应用；其中所述脱氢酶突变体序列为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。
[0039]本专利技术一些实施方案中，其中所述脱氢酶突变体序列为SEQ ID NO：5。
[0040]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0041]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0042]本专利技术的积极进步效果在于：
[0043]本专利技术提供了一种脱氢酶突变体及其应用，及利用其制备甲泼尼龙脱氢物的方法。相较于传统的细胞发酵生产甲泼尼龙脱氢物，本专利技术提供的方法具有反应体系简单，转化周期短，副反应少，成本低等优点。
附图说明
[0044]图1为简单脂肪肝菌转化甲泼尼龙格氏物为甲泼尼龙脱氢物的发酵液液相检测结果，其中底物甲泼尼龙格氏物的出峰时间为18.193min，产物甲泼尼龙脱氢物的出峰时间为17.004min。
[0045]图2为提取简单脂肪肝菌基因组DNA的电泳图，四个泳道均为同时提取的平行组。
[0046]图3为对简单脂肪肝菌基因组DNA中KstD基因扩增电泳图，目的基因大小为1659bp，四个泳道均为平行操作。
[0047]图4为对构建的克隆菌株菌落PCR电泳图，五个泳道为不同的单菌落PCR结果。
[0048]图5为KstD酶的催化结果，底物浓度2mg/mL，转化时间24h。
[0049]图6为产物甲泼尼龙脱氢物的液相图谱。
[0050]图7为底物甲泼尼龙格氏物的液相图谱。
[0051]图8为K本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱氢酶突变体，其特征在于，所述脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述脱氢酶突变体为在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：第315位、第330位或第452
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463位。2.如权利要求1所述的脱氢酶突变体，其特征在于，所述脱氢酶突变体在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：所述第315位的氨基酸残基由F突变为A、G、V或S，所述第330位的氨基酸序列残基由L突变为A、G、V或S，和/或删去所述第452位
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第463位的氨基酸残基。3.如权利要求1所述的脱氢酶突变体，其特征在于，所述脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示，优选为SEQ ID NO：5。4.一种分离的核酸，其中所述核酸编码如权利要求1
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3中任一项所述的脱氢酶突变体。5.一种重组表达载体，其中所述重组表达载体包含如权利要求4所述的核酸；优选地，所述重组表达载体的骨架质粒为pET26b(+)或pET28a(+)。6.一种转化体，其中所述转化体包含如权利要求5所述的重组表达载体；优选地，所述转化体的底盘菌为大肠杆菌，例如大肠杆菌BL21(DE3)。7.一种制备如权利要求1
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3中任一项所述的脱氢酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括将所述转化体在适合的培养基中生长，以产生所述脱氢酶突变体；优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明欣，何鑫，汪声晨，陈海林，杨艳青，
申请(专利权)人：湖北葛店人福药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：