一种参与双苄基异喹啉类生物碱生物合成的偶联酶及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种偶联酶及应用，涉及药用植物基因工程领域，偶联酶StCYP80A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有偶联酶功能的氨基酸序列，或者与该氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有偶联形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的蛋白质；一种共表达StCYP80A和CYP450还原酶StCPR的重组微生物；StCYP80A在催化或者制备BBI的应用；一种重组表达载体、重组微生物以及在制备StCYP80A中的应用。本发明专利技术公开了一种偶联酶StCYP80A及其编码基因，既能催化乌药碱形成单偶联的BBI，又能生成双偶联的BBI。又能生成双偶联的BBI。又能生成双偶联的BBI。

【技术实现步骤摘要】
一种参与双苄基异喹啉类生物碱生物合成的偶联酶及应用


[0001]本专利技术涉及药用植物基因工程领域，尤其涉及一种参与双苄基异喹啉类生物碱生物合成的偶联酶及应用。

技术介绍

[0002]防己为防己科Menispermaceae植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，具有利水消肿、祛风止痛的功效。防己中富含苄基异喹啉型生物碱(BIAs)，尤其是双苄基异喹啉型生物碱(Bisbenzylisoquinoline，BBI)。BBI为防己中的主要活性成分类型，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗心律失常、抗肿瘤等生物活性，代表性成分有粉防己碱、防己诺林碱。但是，目前防己野生资源匮乏，人工种植规模小，种植周期长，活性BBI的含量低，人工合成难度大，难以实现工业化生产，限制了其开发与应用。阐明防己中BBI的生物合成途径及其关键酶，可为利用生物技术生产BBI或提高植物中的目标成分含量奠定基础，也可为药材品质的形成提供理论依据。
[0003]通常认为，BBI的生物合成始自L
‑
酪氨酸代谢转化为多巴胺和4
‑
羟基
‑
苯乙醛，接着依次由去甲乌药碱合酶(NCS)催化形成S
‑
去甲乌药碱((S)
‑
norcoclaurine)，6
‑
氧甲基转移酶(6OMT)催化形成S
‑
乌药碱((S)
‑
coclaurine)，氮甲基转移酶(CNMT)催化形成S
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N<br/>‑
甲基乌药碱((S)
‑
N
‑
methylcoclaurine)，然后在细胞色素P450酶CYP80A的作用下偶联形成形成其二聚体。在上述合成过程中，CYP80A是合成BBI骨架结构的关键酶。
[0004]目前，粉防己中功能明确的CYP80A尚未见报道，其他植物中经功能验证的仅有小檗属植物匍匐小檗(Berberis stolonifera)中发现的BsCYP80A1，即大叶小檗碱合酶(Berbamunine synthase)。BsCYP80A1可以催化(R)
‑
和(S)
‑
N
‑
甲基乌药碱分子间C
‑
O芳基偶联反应生成BBI。BsCYP80A1催化形成的产物为单偶联BBI，不能形成双偶联BBI。而粉防己中多种具有显著生物活性的BBI为双偶联的，包括粉防己碱、千金藤素、小檗胺、防己诺林碱，其中前3种化合物已经开发成药物。因此，发现能催化单苄基异喹啉形成双偶联BBI的CYP80A对粉防己中活性BBI的合成尤为重要，对于其他植物中的BBI合成也有着重要的理论及实际意义。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于开发一种能催化单苄基异喹啉形成双偶联BBI的酶及其应用。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是开发一种能催化单苄基异喹啉形成双偶联BBI的酶及其生成双苄基异喹啉型生物碱中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种偶联酶StCYP80A，包括：
[0008](a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的偶联酶；
[0009](a2)将(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有偶联酶功能的蛋白质；
[0010](a3)与(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有偶联单苄基异喹啉类生物碱形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的蛋白质。
[0011]进一步地，本专利技术的偶联酶蛋白来源于粉防己Stephania tetrandra，命名为StCYP80A。
[0012]进一步地，上述(a3)为来源于粉防己且具有偶联单苄基异喹啉类生物碱形成BBI的蛋白质。
[0013]本专利技术还提供了一种偶联酶StCYP80A的基因，包括：
[0014](b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；
[0015](b2)将(b1)的DNA序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；
[0016](b3)与(b1)的DNA序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80A蛋白的DNA分子；
[0017](b4)(b1)的DNA序列经密码子优化后的序列如序列SEQ ID NO.5所示的DNA序列。
[0018]进一步地，上述(b3)为来源于粉防己且具且编码CYP80A蛋白的DNA分子。
[0019]本专利技术还提供了一种的偶联酶StCYP80A基因的重组表达载体。
[0020]本专利技术还提供了一种的偶联酶StCYP80A基因的重组微生物。
[0021]进一步地，重组载体包括亚克隆载体以及酵母等微生物细胞表达载体；
[0022]进一步地，重组微生物包括酵母等微生物细胞。
[0023]本专利技术还提供了一种共表达重组微生物，该共表达重组微生物共表达偶联酶StCYP80A和CYP450还原酶StCPR；共表达重组微生物包括酵母体系，StCPR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示，经密码子优化后的编码基因如SEQ ID NO.6所示。
[0024]进一步地，上述CYP450还原酶(CYP450 Reductase,CPR)来源于粉防己Stephania tetrandra，命名为StCPR，共表达StCYP80A和StCPR的酵母体系对苄基异喹啉生物碱的偶联产物转化率显著高于仅表达StCYP80A体系的转化率。
[0025]本专利技术还提供了一种偶联酶StCYP80A在催化两个单苄基异喹啉类生物碱分子偶联形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的应用。
[0026]进一步地，偶联酶StCYP80A催化两个单苄基异喹啉类生物碱分子间的C
‑
O芳基偶联形成双苄基异喹啉型生物碱。
[0027]本专利技术还提供了一种偶联酶StCYP80A基因的重组表达载体在制备偶联酶StCYP80A中的应用。
[0028]本专利技术还提供了一种偶联酶StCYP80A基因的重组微生物在制备偶联酶StCYP80A中的应用。
[0029]本专利技术还提供了一种偶联酶StCYP80A的蛋白在制备双苄基异喹啉类生物碱中的应用。
[0030]上述基因、重组载体或重组菌在体外合成双苄基异喹啉类化合物中的应用均属于本专利技术的保护范围。
[0031]在本专利技术的较佳实施方式1中，详细说明粉防己中一种双苄基异喹啉生物碱合成酶(StCYP80A)及其编码基因的发现过程；
[0032]在本专利技术的另一较佳实施方式2中，详细说明酿酒酵母体内验证粉防己来源StCYP80A的功能的过程；
[0033]在本专利技术的另一较佳实施方式3中，详细说明酿酒酵母体内验证密码子优化后StCYP80A的功能的过程；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种偶联酶StCYP80A，其特征在于，所述偶联酶StCYP80A包括：(a1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的所述偶联酶；(a2)将(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有偶联酶功能的蛋白质；(a3)与(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有偶联单苄基异喹啉类生物碱形成双苄基异喹啉型生物碱(BBI)的蛋白质。2.如权利要求1所述的偶联酶StCYP80A的基因，其特征在于，所述基因包括：(b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA序列；(b2)将(b1)的DNA序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；(b3)与(b1)的DNA序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80A蛋白的DNA分子；(b4)所述(b1)的DNA序列经密码子优化后的序列如序列SEQ ID NO.5所示的DNA序列。3.含有权利要求2所述的基因的重组表达载体。4.含有权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建明，瞿旭东，李姚婷，郭弯，雷春，冯郁涵，康云，汪亚勤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：