一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用，涉及药用植物基因工程领域，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，或其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有羟化酶功能的蛋白质；或与其具有90％或90％以上同一性，且具有羟基化苄基异喹啉类生物碱的蛋白质；其重组表达载体、重组微生物；该酶和还原酶StCPR组成的酵母体系，该羟化酶及其重组表达载体在异源表达的StCYP80B蛋白体外合成、重组微生物和该酵母体系在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。本发明专利技术提供的羟化酶StCYP80B，扩大了底物识别范围，是羟基化不同结构单苄基异喹啉类生物碱的有效酶促工具。有效酶促工具。有效酶促工具。

【技术实现步骤摘要】
一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用


[0001]本专利技术涉及药用植物基因工程领域，尤其涉及一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用。

技术介绍

[0002]粉防己Stephania tetrandra S.Moore为防己科Menispermaceae千金藤属Stephania植物，其根为著名的传统中药材防己，具有利水消肿、祛风止痛的功效。防己中富含苄基异喹啉类生物碱(BIAs)，主要包括单苄基异喹啉型、双苄基异喹啉型、阿朴啡型、原小檗碱型等，这些BIAs具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用。但是，目前防己野生资源匮乏，人工种植规模小，种植周期长，有效成分的含量不高，限制了其中活性BIAs的应用与发展。生物合成是解决资源问题的重要手段，阐释粉防己中BIAs生物合成的关键酶，可为利用生物技术高效地生产这类有效成分提供理论基础。
[0003]BIAs的生物合成通常始自L
‑
酪氨酸转化为多巴胺和4
‑
羟基苯基乙醛，在去甲乌药碱合酶(NCS)的催化生成S
‑
去甲乌药碱，然后经3个甲基转移酶(6OMT，CNMT，4
′
OMT)和羟化酶(CYP80B或称为NMCH)形成关键中间体S
‑
牛心果碱((S)
‑
reticuline)，再通过偶联、异构、重排、羟基化、甲基化、去甲基化等反应形成多种类型的BIAs。在上述途径中，从S
‑
去甲乌药碱到S
‑
牛心果碱均为单苄基异喹啉类生物碱，这类化合物的结构修饰对下游多种类型BIAs有重要作用，其中羟化酶CYP80B就是对单苄基异喹啉类起结构修饰的关键酶之一。
[0004]目前，粉防己中功能明确的CYP80B尚未见报道，其他植物中发现的CYP80B，称为N
‑
甲基乌药碱3
′‑
羟化酶，只能催化单一的底物S
‑
N
‑
甲基乌药碱((S)
‑
N
‑
methylcoclaurine)形成S
‑3′‑
羟基
‑
N
‑
甲基乌药碱((S)
‑3′‑
OH
‑
N
‑
methylcoclaurine)，不能催化不具N
‑
甲基的底物乌药碱(coclaurine)，底物谱单一。因此，发现能羟基化不同结构BIA的CYP80B，可以拓宽该类酶的底物谱，对于单苄基异喹啉类及其下游多类型BIAs的合成都有重要的理论和实用价值。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的羟化酶，具有多样的底物谱，以满足对不同结构的苄基异喹啉类生物碱(BIA)进行羟基化的需求。

技术实现思路

[0006]鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何开发一种羟化酶，具有多样的底物谱，能满足对不同结构的苄基异喹啉类生物碱(BIA)进行羟基化的需求。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶StCYP80B，羟化酶StCYP80B氨基酸序列为：
[0008](a1)羟化酶StCYP80B氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]或(a2)上述(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有羟化酶功能的蛋白质的氨基酸序列；
[0010]或(a3)与上述(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有羟基化苄基
异喹啉类生物碱的蛋白质的氨基酸序列。
[0011]进一步地，羟化酶StCYP80B核苷酸序列为：
[0012](b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0013]或(b2)将上述(b1)的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；
[0014]或(b3)与上述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80B蛋白的DNA分子。
[0015]本专利技术还提供了一种羟化酶StCYP80B的基因的重组表达载体，该重组载体包括亚克隆载体或酵母细胞表达载体。
[0016]进一步地，含有StCYP80B基因的重组载体包括亚克隆载体以及酵母等微生物细胞表达载体。
[0017]本专利技术还提供了一种羟化酶StCYP80B的基因的重组微生物，该重组微生物包括酵母细胞。
[0018]进一步地，含有StCYP80B基因的重组微生物包括酵母等微生物细胞。
[0019]本专利技术还提供了一种共表达StCYP80B和StCPR的酵母体系，该酵母体系组成为羟化酶StCYP80B和还原酶StCPR。
[0020]进一步地，还原酶StCPR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示。
[0021]本专利技术还提供了一种羟化酶StCYP80B在体外合成苄基异喹啉类化合物中的应用。
[0022]本专利技术还提供了一种含有StCYP80B基因的重组表达载体在异源表达的StCYP80B蛋白体外合成的应用。
[0023]本专利技术还提供了一种含有StCYP80B基因的重组微生物在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。
[0024]本专利技术还提供了一种酵母体系在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。
[0025]进一步地，羟化酶蛋白来源于粉防己Stephania tetrandra，命名为StCYP80B，
[0026]进一步地，CYP450还原酶(CYP450 Reductase,CPR)来源于粉防己Stephania tetrandra，命名为StCPR。
[0027]进一步地，共表达StCYP80B和StCPR的酵母体系对苄基异喹啉生物碱的羟化转化率显著高于仅表达StCYP80B体系的转化率。
[0028]进一步地，羟化酶StCYP80B催化不具N
‑
甲基的底物乌药碱(coclaurine)的应用。
[0029]进一步地，StCYP80B作为羟化酶的应用。
[0030]进一步地，StCYP80B基因在制备羟化酶中的应用。
[0031]进一步地，含有StCYP80B基因的重组表达载体在制备羟化酶中的应用。
[0032]进一步地，含有StCYP80B基因的重组微生物在制备羟化酶中的应用。
[0033]进一步地，StCYP80B的蛋白在参与苄基异喹啉类生物碱的生物合成中的应用。
[0034]进一步地，StCYP80B的蛋白在制备苄基异喹啉类生物碱中的应用。
[0035]进一步地，羟化酶StCYP80B既能催化单一的底物S
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N
‑
甲基乌药碱((S)
‑
N
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶StCYP80B，其特征在于，所述羟化酶StCYP80B氨基酸序列为：(a1)所述羟化酶StCYP80B氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或(a2)所述(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有羟化酶功能的蛋白质的氨基酸序列；或(a3)与所述(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有羟基化苄基异喹啉类生物碱的蛋白质的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的羟化酶StCYP80B，其特征在于，所述羟化酶StCYP80B核苷酸序列为：(b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；或(b2)将所述(b1)的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；或(b3)与所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80B蛋白的DNA序列。3.含有如权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建明，瞿旭东，李姚婷，冯郁涵，郭弯，康云，汪亚勤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：