瓦伦西亚烯氧化酶突变体及其在制备圆柚酮中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种瓦伦西亚烯氧化酶突变体及其在制备圆柚酮中的应用。本发明专利技术通过定点突变技术构建了HPO突变体的基因文库，通过静息细胞体外催化实验测定，在相同条件下，最优HPO突变体(HPO_G302G

【技术实现步骤摘要】
瓦伦西亚烯氧化酶突变体及其在制备圆柚酮中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及了一种氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示的瓦伦西亚烯氧化酶(HPO)突变体及其重组表达细胞在生物法制备圆柚酮中的应用，涉及编码所述酶的核酸序列、包含所述编码核酸序列的重组表达载体及用于制备圆柚酮的方法。

技术介绍

[0002]圆柚酮(Nootkatone)，也叫诺卡酮等，最早是从阿拉斯加黄扁柏(Callitropsis nootkatensis)芯材中分离得到的，也普遍存在于葡萄柚、甜橙等水果中。因其具有浓烈且持久的带有木质香气的柑橘果香，由此成为食品和香料行业高价值和高需求的芳香化合物。此外，圆柚酮还是一种有效且环保的驱虫剂，可以驱除蚊子、蜱虫等昆虫。近年发现圆柚酮及其衍生物还有抑制癌细胞增殖、抗血小板凝集、激活能量代谢等生理活性，因此也是潜在的药物前体分子。
[0003]然而，受限于从天然来源中提取这种化合物的成本高昂且产量不足。因此，在工业生产中通常是采用氧化廉价且大量可用的瓦伦西亚烯(Valencene)制备圆柚酮。然而，化学氧化方法不可避免的依赖于不安全的试剂，如过乙酸叔丁酯、三氧化铬、铬酸叔丁酯或其他一些重金属盐类，且对环境造成严重的危害(Hunter GLK,et al.Conversion of valencene tonootkatone[J].Journal of Food Science,1965,30(5):876
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878.)。近年来，得益于合成生物学领域的飞速发展，采用生物技术催化瓦伦西亚烯生成圆柚酮已成为新的探索方向与研究趋势。
[0004]2007年，Shunji Takahashi等从天仙子(Hyoscyamus muticus)的细胞悬浮培养物中，分离得到一种可以催化瓦伦西亚烯的烯丙基C
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2位羟基化的酶(NCBI登录号为EF569601.1)，该酶英文全称为Hyoscyamus muticus premnaspirodiene oxygenase，简称为HPO，这是文献首次发掘HPO并对其进行功能表征。后续陆续有研究发现并证实，HPO确实具备催化瓦伦西亚烯羟基化生成圆柚醇的功能，2020年，Xiangfeng Meng等发现在酿酒酵母W303
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1A菌株中，共表达瓦伦西亚烯合成酶(CnVS，NCBI登陆号为JX040471)、HPO、AtCPR(HPO的氧化还原伴侣，NCBI登录号为NM_118585)、来自红球姜(Zingiber zerumbet)的醇脱氢酶ZSD1(NCBI登录号为AB480831)，可以实现圆柚酮的从头合成，但是产量仅为59.78mg/L，与此同时，发酵液中残留大量瓦伦西亚烯(Meng X,et al.Metabolic engineering Saccharomyces cerevisiae for de novo production of the sesquiterpenoid(+)
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nootkatone[J].Microbial Cell Factories,2020,19.)。由此可见，囿于这一过程中的关键限速酶，即HPO的表达水平和催化能力不足，尤其是在较高瓦伦西亚烯浓度时其催化活性受到抑制，圆柚酮依然面临严峻的产量瓶颈的问题。
[0005]蛋白质工程作为已知的提高酶催化性能的有力手段，已经被成功的运用于提高脂肪酶、纤维素水解酶等的催化性能研究中，同样被研究者用于探索HPO的设计与改造中。2019年，欧阳小丹等通过重叠延伸PCR技术构建了HPO的突变体(V482I
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A484I)，并将该突变
体基因、AtCPR共表达至酿酒酵母CEN.PK2
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1Ca菌株中，通过静息细胞实验，发现HPO突变体(V482I
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A484I)并不能提高圆柚醇产量，即该HPO突变体催化瓦伦西亚烯羟基化的能力没有提高(欧阳小丹.酿酒酵母中瓦伦西亚烯及其衍生物合成途径的构建和优化[D].华南理工大学,2019.)。同年，刘慧等继续通过定点突变技术探究HPO的催化能力提高的可能性，研究者设计了12个HPO突变体，将其转入实验室前期构建的高产瓦伦西亚烯的酵母菌株，经过气相色谱检测，均未检测到圆柚醇和圆柚酮生成，即12个HPO突变体均没有催化活性(刘慧.酿酒酵母合成植物倍半萜类圆柚酮代谢途径的设计与构建[D].山东大学,2019.)。
[0006]综上所述，虽然根据实验研究和文献报道，HPO的催化性能是制约圆柚酮产量提高的重要因素，但是由于HPO本身作为一种植物来源的P450酶，其催化机理复杂、蛋白质分离纯化困难(植物膜蛋白)、缺乏蛋白质晶体结构信息、缺乏适配于定向进化HPO的高通量筛选方法等，尽管从2007年HPO问世以来已有多位研究者致力于通过生物工程技术提高其催化性能，然而至今，未见有关于成功获得能够高产圆柚酮的HPO突变体的任何文献报道。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种瓦伦西亚烯氧化酶突变体。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供上述瓦伦西亚烯氧化酶突变体在制备圆柚酮中的应用。
[0009]瓦伦西亚烯氧化酶HPO于2007年从天仙子(Hyoscyamus muticus)中首次被发掘并被证实其具备生物合成圆柚酮的能力，但囿于该酶的野生型(其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)于酿酒酵母异源表达时催化性能不足，因此制约圆柚酮产量的提高。
[0010]本专利技术所要解决的技术问题是针对瓦伦西亚烯氧化酶HPO作为生物合成圆柚酮的关键限速酶但其催化性能不能满足工业化生产需求这一现状，提供一系列高效的HPO突变体。其在以酿酒酵母为细胞工厂，采用生物法制备圆柚酮的过程中，表现出了特异性转化能力强、转化率高等优点。
[0011]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0012]本专利技术中，所述瓦伦西亚烯氧化酶HPO来源于天仙子(Hyoscyamus muticus)，英文全称为Hyoscyamus muticus premnaspirodiene oxygenase，蛋白质的NCBI登录号为ABS00393.1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，共包含502个氨基酸；HPO基因的NCBI登录号为EF569601.1，长度为1509bp。
[0013]本专利技术中，所述瓦伦西亚烯氧化酶HPO(野生型)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，共包含1509个核苷酸，是在NCBI登录号为EF569601.1所示序列基础上，进行酵母密码子优化后得到的，这是HPO基因在酿酒酵母中异源表达的必须步骤。
[0014]本专利技术中，进一步提供与序列表中SEQ ID No.2所示的瓦伦西亚烯氧化酶HPO(野生型)相比，具有更高的转化效率和底物耐受性的HPO突变体序列。
[0015]优选的，瓦伦西亚烯氧化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.瓦伦西亚烯氧化酶HPO突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，SEQ ID No.3中至少一个标注为“X”的位点与SEQ ID No.1的相应位点的氨基酸残基突变；SEQ ID No.3的第302位、第484位的氨基酸为同义突变；具体是SEQ ID No.3的第302位氨基酸密码子由SEQ ID No.2中的GGC突变为GGG，SEQ ID No.3的第484位氨基酸密码子由SEQ ID No.2中的GCT突变为GCG。2.根据权利要求1所述的瓦伦西亚烯氧化酶HPO突变体，其特征在于：所述突变体具有选择以下的一个位点或多个位点组合突变：302G、365A、480A、480T、480G、482A、482C、484A；其中，302G、484A为同义突变。3.根据权利要求2所述的瓦伦西亚烯氧化酶HPO突变体，其特征在于：该HPO突变体为HPO_G302G
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V480A
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V482A
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【专利技术属性】
技术研发人员：李爽，刘彤，李文，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：