一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法技术

本发明专利技术属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法。本发明专利技术提供的纯化方法：将人源线粒体复合物总蛋白溶液装入填装有Anti

【技术实现步骤摘要】
一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法


[0001]本专利技术属于蛋白纯化
，具体涉及一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法。

技术介绍

[0002]呼吸链复合物Ⅱ又称琥珀酸脱氢酶(Succinatedehydrogenase,SDH)，可以同时参与三羧酸循环(Tricarboxylicacid,TCA)和氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)这两个重要的生命活动过程，并且以纽带的方式将这两个能量产生过程偶联在一起。由于呼吸链复合物Ⅱ在生物体正常生命活动过程中发挥重要作用，当人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ(HumancomplexⅡ,hCⅡ)的亚基发生突变会引起活性受损，会引起一系列临床相关的线粒体疾病，比如代谢异常相关疾病、肿瘤等。
[0003]研究人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的结构与功能，对于深入了解人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ催化机制、突变致病机制及药物发现等都具有意义。近年来，哺乳动物像猪心线粒体呼吸链复合物Ⅱ的结构和功能研究有了重大进展，但是至今仍无人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ纯化和结构解析的报道。
[0004]当前用于研究人源线粒体呼吸链蛋白复合物主要手段是密度梯度离心结合阴阳离子交换柱纯化，但上述方法需要超速离心机，对设备要求较高，工艺复杂，并且获得的蛋白纯度不高。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法，本专利技术提供的纯化方法能获得高纯度人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ，且生产成本低。r/>[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法，包括以下步骤：
[0008]将人源线粒体复合物总蛋白溶液装入第一色谱柱中进行亲和柱层析纯化，采用第一洗脱剂进行第一洗脱后收集第一洗脱液，得到人源线粒体呼吸链复合物II粗提液；所述第一色谱柱为填装有Anti
‑
Flag填料的色谱柱；所述人源线粒体复合物总蛋白溶液中的人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的SDHD亚基C端融合有3
×
Flag标签；
[0009]将所述人源线粒体呼吸链复合物II粗提液装入第二色谱柱中进行凝胶排阻柱层析纯化，采用第二洗脱剂进行第二洗脱后收集第二洗脱液，得到所述人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ纯品；所述第二色谱柱为凝胶排阻色谱柱。
[0010]优选的，所述第一洗脱剂包括3
‑
吗啉丙磺酸、NaCl、第一去污剂和1
×
Flag peptide；所述第一洗脱剂中，所述3
‑
吗啉丙磺酸的摩尔浓度为20mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述第一去污剂的质量百分含量为0.004％、0.02％或0.03％，所述1
×
Flagpeptide的质量浓度为200μg/mL。
[0011]优选的，所述第一洗脱之前，还包括采用除杂剂进行预洗脱除杂；所述除杂剂包括
3
‑
吗啉丙磺酸、NaCl和第二去污剂；所述除杂剂中，所述3
‑
吗啉丙磺酸的摩尔浓度为20mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述第二去污剂的质量百分含量为0.004％、0.02％或0.03％。
[0012]优选的，所述第二洗脱剂包括3
‑
吗啉丙磺酸、NaCl和第三去污剂；所述第二洗脱剂中，所述3
‑
吗啉丙磺酸的摩尔浓度为20mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述第三去污剂的质量百分含量为0.004％、0.02％或0.03％。
[0013]优选的，所述第二洗脱时，所述第二洗脱剂的流速为0.5mL/min；所述第二洗脱的压力为1.5MPa。
[0014]优选的，所述第一去污剂、第二去污剂和第三去污剂均为月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)
、
糖酵素(GND)或十二烷基
‑
β
‑
D
‑
麦芽糖苷(DDM)。
[0015]优选的，得到第一洗脱液后，还包括：将所述第一洗脱液装入浓缩管中，离心浓缩，得到所述人源线粒体呼吸链复合物II粗提液；所述浓缩管的截留分子量为100KDa。
[0016]优选的，所述人源线粒体复合物总蛋白溶液的制备方法包括以下步骤：
[0017]采用pQCXIP质粒建立人源细胞
‑
SDHD
‑3×
Flag过表达稳转细胞系；
[0018]将所述人源细胞
‑
SDHD
‑3×
Flag过表达稳转细胞系和第一缓冲溶液混合研磨，固液分离得到人源线粒体粗提物；所述第一缓冲溶液包括蔗糖(sucrose)、3
‑
吗啉丙磺酸(MOPS)和乙二醇
‑
双
‑
(2
‑
氨基乙醚)四乙酸(EGTA)；所述第一缓冲溶液中，所述sucrose的摩尔浓度为250mmol/L，所述MOPS的摩尔浓度为20mmol/L，所述EGTA的摩尔浓度为1mmol/L；
[0019]将所述人源线粒体粗提物和第二缓冲溶液混合进行线粒体溶膜，固液分离得到所述人源线粒体复合物总蛋白溶液；所述第二缓冲溶液包括3
‑
吗啉丙磺酸、NaCl和第四去污剂；所述第二混合溶液中，所述3
‑
吗啉丙磺酸的摩尔浓度为20mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述第四去污剂的质量百分含量为1％。
[0020]优选的，所述第四去污剂包括月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)和/或十二烷基
‑
β
‑
D
‑
麦芽糖苷(DDM)；所述线粒体溶膜的时间为30～60min。
[0021]优选的，所述人源细胞
‑
SDHD
‑3×
Flag过表达稳转细胞系的建立方法包括以下步骤：
[0022]采用分子克隆方法在人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的SDHD亚基C端融合3
×
Flag标签，构建pQCXIP
‑
SDHD
‑3×
Flag质粒；
[0023]采用所述pQCXIP
‑
SDHD
‑3×
Flag质粒通过转染试剂化学转染人源细胞，得到转染pQCXIP
‑
SDHD
‑3×
Flag质粒的人源细胞液；
[0024]将所述转染pQCXIP
‑
SDHD
‑3×
Flag质粒的人源细胞液和嘌呤霉素混合进行细胞筛选，得到人源细胞
‑
SDHD
‑3×
Flag过表达稳转细胞系。
[0025]本专利技术提供了一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法，包括以下步骤：将人源线粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将人源线粒体复合物总蛋白溶液装入第一色谱柱中进行亲和柱层析纯化，采用第一洗脱剂进行第一洗脱后收集第一洗脱液，得到人源线粒体呼吸链复合物II粗提液；所述第一色谱柱为填装有Anti
‑
Flag填料的色谱柱；所述人源线粒体复合物总蛋白溶液中的人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ的SDHD亚基C端融合有3
×
Flag标签；将所述人源线粒体呼吸链复合物II粗提液装入第二色谱柱中进行凝胶排阻柱层析纯化，采用第二洗脱剂进行第二洗脱后收集第二洗脱液，得到所述人源线粒体呼吸链复合物Ⅱ纯品；所述第二色谱柱为凝胶排阻色谱柱。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述第一洗脱剂包括3
‑
吗啉丙磺酸、NaCl、第一去污剂和1
×
Flagpeptide；所述第一洗脱剂中，所述3
‑
吗啉丙磺酸的摩尔浓度为20mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述第一去污剂的质量百分含量为0.004％、0.02％或0.03％，所述1
×
Flagpeptide的质量浓度为200μg/mL。3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述第一洗脱之前，还包括采用除杂剂进行预洗脱除杂；所述除杂剂包括3
‑
吗啉丙磺酸、NaCl和第二去污剂；所述除杂剂中，所述3
‑
吗啉丙磺酸的摩尔浓度为20mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述第二去污剂的质量百分含量为0.004％、0.02％或0.03％。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述第二洗脱剂包括3
‑
吗啉丙磺酸、NaCl和第三去污剂；所述第二洗脱剂中，所述3
‑
吗啉丙磺酸的摩尔浓度为20mmol/L，所述NaCl的摩尔浓度为100mmol/L，所述第三去污剂的质量百分含量为0.004％、0.02％或0.03％。5.根据权利要求1或4所述的纯化方法，其特征在于，所述第二洗脱时，所述第二洗脱剂的流速为0.3～0.5mL/min；所述第二洗脱的压力为1.5～1.8MPa。6.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述第一去污剂、第二去污剂和第三去污剂均为月桂基麦芽糖新戊二醇
、
糖酵素或十二烷基
‑
β
‑
D
‑
麦芽糖苷。7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，得到第一洗脱液后，还包括：将所述第一洗脱液装入浓缩管中，离心浓缩，得到所述人源线粒体呼吸链复合物II粗提液；所述浓缩管的截留分子量为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡红日，饶子和，杜占强，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：