一种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种4

【技术实现步骤摘要】
一种4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]白皮杉醇是一种带有邻位羟基的儿茶酚类化合物，其可以看作是白藜芦醇经邻位羟基化形成的(图1)。研究表明，其具有卓越的抗氧化、消炎、抗病毒、抗癌、降血糖和改善血液循环的生理功能，在食品、医药和化妆品领域具有重要的应用价值。此外，白皮杉醇也是多种药物和化工产品的合成前体。自然界中，白皮杉醇主要存在于葡萄、百香果和蓝莓中，但天然来源中白皮杉醇的含量相对较低，从植物中提取相对困难。利用应用化学法合成白皮杉醇存在合成步骤多，反应条件苛刻，因此，直接(芳香族)羟基化的方法数量仍然有限。相比之下，利用生物催化剂对具有苯酚结构的物质进行邻位羟基化来制备白皮杉醇的生物转化法则因其反应条件温和、选择性高和环境友好的优点，得到了人们普遍关注与青睐。
[0003]目前，主要有三类酶可以实现单酚类化合物的邻位羟化：细胞色素P450羟化酶、多酚氧化酶和4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶(p
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Hydroxyphenylacetate
‑3‑
hydroxylase，4HPA3H，EC 1.14.13.3)。尽管细胞色素P450羟化酶和酚氧化酶可以实现单酚化合物的邻位羟基化生成儿茶酚类化合物，但它们在实际应用中都存在着难以克服的问题，比如，植物源的P450酶系难以在细菌细胞内得到活性表达；微生物源的P450羟化酶普遍催化效率低下；酚氧化酶催化形成的醌类物质需经还原才能得到儿茶酚类物质。相比之下，4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶由于其易于表达、且可以专一对单酚进行邻位羟基化生成儿茶酚，成为了儿茶酚类化合物制备的首选用酶。4HPA3H是细菌降解4
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羟基苯乙酸(4HPA)的关键酶，它不仅可以对4PHA进行邻位羟基化，而且对众多苯酚类物质也具有良好的催化活性，展现了较广的底物谱([1]Deng Y,Faivre B,Back O,et al.Structural and Functional Characterization of 4
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Hydroxyphenylacetate 3
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Hydroxylase from Escherichia coli[J].Chembiochem,2020,21(1
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2):163
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170.[2]Xun L Y,Sandvik E R.Characterization of 4
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hydroxyphenylacetate 3
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hydroxylase(HpaB)of Escherichia coli as a reduced flavin adenine dinucleotide
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utilizing monooxygenase[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(2):481
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486.)。
[0004]尽管4HPA3H能够催化白藜芦醇生成白皮杉醇，但与其天然底物相比，其对大分子白藜芦醇的催化效率明显降低，严重制约了其在白藜芦醇等大分子儿茶酚类化合物中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了三种4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶的突变体，这三种酶具有高于野生型4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶的酶活力，能高效催化合成白皮杉醇。
[0006]一种4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶突变体，由大肠杆菌(Escherichia coli)来源的野
生型4HPA3H酶(WT)经过突变所得，野生型4HPA3H酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，突变方式为以下一种：
[0007](1)G209F；
[0008](2)A298F；
[0009](3)G209F/A298F。
[0010]本专利技术又提供了编码所述4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶突变体的基因。
[0011]本专利技术又提供了包含所述基因的重组质粒。
[0012]本专利技术又提供了包含所述基因的基因工程细胞。
[0013]本专利技术又提供了所述4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶突变体在催化白藜芦醇生成白皮杉醇中的应用。
[0014]本专利技术又提供了所述基因在催化白藜芦醇生成白皮杉醇中的应用。
[0015]本专利技术又提供了所述基因工程细胞在催化白藜芦醇生成白皮杉醇中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种催化白藜芦醇生成白皮杉醇的方法，包括以下步骤：以白藜芦醇为底物，添加所述4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶突变体进行催化反应生成白皮杉醇。
[0017]本专利技术还提供了一种催化白藜芦醇生成白皮杉醇的方法，包括以下步骤：以白藜芦醇为底物，添加所述基因工程细胞进行催化反应生成白皮杉醇。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0019]本专利技术4
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羟基苯乙酸
‑3‑
羟化酶突变体由大肠杆菌(Escherichia coli)来源的野生型4HPA3H酶经过突变所得，其中G209F、A298F两种突变体全细胞催化白藜芦醇活性相对于WT提高了2.06和1.45倍，同时将两个位点进行叠加所得的突变体G209F/A298F全细胞催化白藜芦醇活性相较于WT提高了1.50倍。
附图说明
[0020]图1为4HPA3H催化白藜芦醇制白皮杉醇反应示意图。
[0021]图2为WT以及突变体蛋白纯化图。
[0022]图3为WT以及突变体生产白皮杉醇的量。
具体实施方式
[0023]本专利技术是在大肠杆菌(Escherichia coli)的4HPA3H(EC 1.14.13.3)基础上，通过定点突变PCR在底物口袋域上引入209和298位点的突变，获得催化白藜芦醇效率优于WT的突变体G209F，A298F。
[0024]野生型4
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羟基苯乙酸
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羟化酶(4HPA3H)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，G209F突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，A298F突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，G209F/A298F突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。编码野生型4
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羟基苯乙酸
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羟化酶(4HPA3H)的核苷酸序列如SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种4
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羟基苯乙酸
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羟化酶突变体，其特征在于，由大肠杆菌(Escherichia coli)来源的野生型4HPA3H酶经过突变所得，野生型4HPA3H酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，突变方式为以下一种：(1)G209F；(2)A298F；(3)G209F/A298F。2.编码权利要求1所述4
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羟基苯乙酸
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羟化酶突变体的基因。3.包含权利要求2所述基因的重组质粒。4.包含权利要求2所述基因的基因工程细胞。5.权利要求1所述4
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟睿，张前超，胡升，梅乐和，黄俊，吕常江，
申请(专利权)人：浙大宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：