Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响制造技术

本发明专利技术属于生物细胞技术领域，具体的说是Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响，S1：选用细胞培养，并对细胞进行重组腺病毒；S2：建立大鼠去卵巢(OVX)模型，并通过ELISA法测量大鼠血清；S3：提取选用细胞的RNA，同时对cDNA制备，并对PCR、蛋白和Western blot检测，同时对碱性磷酸酶(ALP)活性测定；S4：小鼠颅骨缺损模型建立；S5：液相色谱

【技术实现步骤摘要】
Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响


[0001]本专利技术属于生物细胞
，具体的说是Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

技术介绍

[0002]BMP9是骨形态发生蛋白(BMP)家族的一员，在间充质干细胞(MSCs)中BMP9比BMP7或BMP2具有更大的成骨诱导潜能。BMP9可通过经典BMP/Smad通路和非经典BMP/Smad通路促进MSCs成骨分化，如Wnt/β
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catenin和PI3K/Akt信号通路。其中，Wnt/β
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catenin信号对成骨至关重要可在干细胞分化的早期被激活，但在成骨细胞成熟阶段被抑制[4]。Wnt/β
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catenin活性可受多种因素调控，如Wnt配体、Wnt抑制因子1(Wif1)、Dickkopf 1(Dkk1)、骨硬化蛋白(SOST)等。此外，β
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catenin还可以通过翻译后修饰进行调节，如β
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catenin的磷酸化和乙酰化。在诱导前体细胞向成骨细胞分化时，BMP9可激活Wnt/β
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catenin信号通路。但BMP9如何激活Wnt/β
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catenin信号尚未完全阐明。
[0003]瘦素(Leptin)是由167个氨基酸组成的多肽，主要表达于白色脂肪组织、骨髓等组织。这种多肽最初是在遗传肥胖的大鼠身上发现的，Leptin在血浆中与其受体结合调节摄食和能量平衡，在调节体内能量代谢中发挥关键作用[8,9]。先前的研究表明，高水平的葡萄糖或Leptin通过促进丙二酰辅酶a的分泌来抑制糖酵解过程，丙二酰辅酶a是葡萄糖代谢的负反馈调节因子，通过促进糖酵解途径的关键调节因子丙二酰化来实现。在骨重建过程中，瘦素可以通过抑制成骨细胞增殖或通过增加NF
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κB受体活化因子配体的表达来促进破骨细胞的吸收，从而调节骨形成与骨吸收之间的平衡。瘦素还通过下调c
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myc和Cyclin D1[14]的表达抑制成骨细胞增殖。然而，其机制尚不明确。糖酵解是成骨分化过程中的主要能量来源，同时研究发现成骨关键通路Wnt/β
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catenin可通过肝癌相关巨噬细胞激活糖酵解，促进上皮
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间充质转化。瘦素可以通过促进丙二酰辅酶A的分泌来调节糖酵解过程。因此，瘦素可能通过修饰某些关键的成骨调节因子参与调控BMP9的成骨潜能。
[0004]Sirt5是一种NAD+依赖性蛋白脱酰基酶，定位于细胞质和线粒体，参与调节多种代谢途径。Sirt5可以通过去除靶点赖氨酸残基上的丙二酰化来调节糖酵解途径。丙二酰辅酶A是丙二酰化化合物的供体，可由丙二酰辅酶A脱羧酶代谢。丙二酰辅酶A通过促进关键靶点的丙二酰化来发挥代谢的负反馈调节作用。相反，Sirt5通过去甲基化恢复这些靶点的活性，从而正向调节代谢。Sirt5作为赖氨酸丙二酰化的全局调节因子，通过与丙二酰辅酶a维持内环境稳态在多种疾病中发挥重要作用。然而，Sirt5在成骨分化中的作用尚不清楚。
[0005]为了证明了瘦素对BMP9诱导的MSCs成骨分化的影响，并探讨Wnt/β
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catenin和Sirt5是否参与这一过程，为此，本专利技术提供Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。

技术实现思路

[0006]为了弥补现有技术的不足，解决上述至少一个问题，本专利技术提出的Leptin/Sirt5
对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术所述的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响,该方法步骤如下所示：
[0008]S1：选用细胞培养，并对细胞进行重组腺病毒；
[0009]S2：建立大鼠去卵巢(OVX)模型，并通过ELISA法测量大鼠血清；
[0010]S3：提取选用细胞的 RNA，同时对cDNA制备，并对PCR、蛋白和Westernblot检测，同时对碱性磷酸酶(ALP)活性测定；
[0011]S4：小鼠颅骨缺损模型建立；
[0012]S5：液相色谱
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串联质谱分析；
[0013]S6：共聚焦分析和免疫沉淀法，并记录统计数据。
[0014]优选的，所述S1的具体方法步骤如下所示：
[0015]选用细胞为贴壁培养的细胞HEK293、C3H10T1/2、3T3
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L1和MC3T3
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E1，同时将细胞在含有10％FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科DMEM(High Glucose)培养基中培养，并置于37℃、5％ CO2孵育箱中培养；并通过用AdEasy系统表达Leptin或Leptin siRNA寡核苷酸的重组病毒，将重组腺病毒在HEK293细胞中包装，这些细胞被命名为AdBMP9、AdLeptin和AdsiLeptin；用绿色荧光蛋白(GFP)标记AdBMP9和AdLeptin，用红色荧光蛋白(RFP)标记AdsiLeptin；只表达单体RFP (AdRFP)或GFP (AdGFP)的腺病毒作为载体对照。
[0016]优选的，所述S2的具体方法步骤如下所示：
[0017]A1：选取雌性10只SD大鼠，随机分为OVA组和Sham组，将OVA组采用水合氯醛(4mg /kg)腹腔麻醉，俯卧位固定在手术台上，进行消毒，皮肤被放置在左大腿根部的上边缘，在背部中线处0.5 cm处开0.5 cm切口，用镊子沿腰大肌提起脂肪团的表面肌层，沿外侧边缘被切去约0.5 cm以找到左侧卵巢，摘除卵巢后，用5
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0丝线结扎输卵管，右侧卵巢也通过同样的程序被切除；
[0018]A2：采用ELISA法测定OVX大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨钙素(OCN)和Leptin水平，用分光光度计(Varioskan 3020, Thermo Scientific)在450 nm处测量吸光度。
[0019]优选的，所述S3中提取选用细胞的 RNA，同时对cDNA制备的步骤如下所示：
[0020]B1：选用细胞经不同因素处理后，于24h、48后结束培养，弃培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，放置于冰上加入400μl TRIZOL裂解10min，用无酶枪头反复吹打，收集细胞裂解液于1.5mlEP管中，然后在EP管中加入200μl氯仿，缓慢颠倒混匀20秒，置于冰上等待5min, 4℃低温超速离心12000g,10min；
[0021]B2：取出EP管，用无酶枪头小心吸取上层液体大约400μl于另一EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后静止10min,低温超速离心12000g，10min；
[0022]B3：弃上清液，加入75％乙醇(DEPC水配置)500μl,轻轻颠倒混匀3次，4℃低温离心7500g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响，其特征在于，该方法步骤如下所示：S1：选用细胞培养，并对细胞进行重组腺病毒；S2：建立大鼠去卵巢(OVX)模型，并通过ELISA法测量大鼠血清；S3：提取选用细胞的RNA，同时对cDNA制备，并对PCR、蛋白和Western blot检测，同时对碱性磷酸酶(ALP)活性测定；S4：小鼠颅骨缺损模型建立；S5：液相色谱
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串联质谱分析；S6：共聚焦分析和免疫沉淀法，并记录统计数据。2.根据权利要求1所述的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响，其特征在于，所述S1的具体方法步骤如下所示：选用细胞为贴壁培养的细胞HEK293、C3H10T1/2、3T3
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L1和MC3T3
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E1，同时将细胞在含有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的杜尔贝科DMEM(High Glucose)培养基中培养，并置于37℃、5％CO2孵育箱中培养；并通过用AdEasy系统表达Leptin或Leptin siRNA寡核苷酸的重组病毒，将重组腺病毒在HEK293细胞中包装，这些细胞被命名为AdBMP9、AdLeptin和AdsiLeptin；用绿色荧光蛋白(GFP)标记AdBMP9和AdLeptin，用红色荧光蛋白(RFP)标记AdsiLeptin；只表达单体RFP(AdRFP)或GFP(AdGFP)的腺病毒作为载体对照。3.根据权利要求2所述的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响，其特征在于，所述S2的具体方法步骤如下所示：A1：选取雌性10只SD大鼠，随机分为OVA组和Sham组，将OVA组采用水合氯醛(4mg/kg)腹腔麻醉，俯卧位固定在手术台上，进行消毒，皮肤被放置在左大腿根部的上边缘，在背部中线处0.5cm处开0.5cm切口，用镊子沿腰大肌提起脂肪团的表面肌层，沿外侧边缘被切去约0.5cm以找到左侧卵巢，摘除卵巢后，用5
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0丝线结扎输卵管，右侧卵巢也通过同样的程序被切除；A2：采用ELISA法测定OVX大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨钙素(OCN)和Leptin水平，用分光光度计(Varioskan 3020,Thermo Scientific)在450nm处测量吸光度。4.根据权利要求3所述的Leptin/Sirt5对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的影响，其特征在于，所述S3中提取选用细胞的RNA，同时对cDNA制备的步骤如下所示：B1：选用细胞经不同因素处理后，于24h、48后结束培养，弃培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，放置于冰上加入400μl TRIZOL裂解10min，用无酶枪头反复吹打，收集细胞裂解液于1.5mlEP管中，然后在EP管中加入200μl氯仿，缓慢颠倒混匀20秒，置于冰上等待5min,4...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯凯馨，何百成，何文葛，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：