高产田麦角碱重组酵母构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及高产田麦角碱重组酵母构建方法与应用。本发明专利技术通过确定生物合成田麦角碱异源途径酶(DmaW，EasF，EasE，EasC，EasD，EasA，EasG)在酿酒酵母菌株中的亚细胞表达场所来重构异源合成途径实现田麦角碱的产量优化。本发明专利技术确定了生物合成田麦角碱异源途径酶(DmaW，EasF，EasE，EasC，EasD，EasA，EasG)在酿酒酵母菌株中的亚细胞表达场以及表达水平，也进一步证明了该异源途径的引入会引起内源环境的辅因子不平衡，为后续继续优化提产田麦角碱提供了有利证据，也为以田麦角碱为前体生物合成麦角酸衍生物提供了一个高产底盘。高产底盘。

【技术实现步骤摘要】
高产田麦角碱重组酵母构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及高产田麦角碱重组酵母构建方法与应用。

技术介绍

[0002]麦角生物碱主要是曲霉(Aspergillus)，麦角菌属(Claviceps)，以及内生真菌(Neotyphodium)这三类真菌的次生代谢产物，它是一类具有较强药理活性的真菌类吲哚类生物碱天然产物，是治疗偏头痛、子宫出血、帕金森症和其他疾病的治疗药物的原料。生物碱类药物通常从植物提取的起始原料中半合成，这往往限制了它们的可用性和最终价格。近年来合成生物学的进展使得将完整的植物途径引入微生物中来生产植物生物碱成为可能。
[0003]微生物生产改性生物碱具有加速生物碱类药物半合成的潜力，它提供了结构上更接近最终药物的高级中间体，可作为新型药物合成的高级中间体。几十年来，人们对麦角生物碱进行了深入的研究，主要是因为它们在受污染的食品和饲料中的有害作用，但也因为它们在医药和农业方面的有益应用。
[0004]麦角生物碱合成的源头底物为色氨酸和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)，尽管目前其生物合成路径中的共同前体可以确定为裸麦角碱，但是裸麦角碱的下游合成路径并不是十分清晰，具体的催化机理，反应机制不清楚。而涉及chanoclavine
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I形成的一共需要四个酶，分别为DamW和EasF、EasE和EasC，DamW和EasF这两步酶不是限制chanoclavine
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I形成的因素，关键是EasE和EasC的研究。研究者成功地在酿酒酵母中以色氨酸和DMAPP合成了裸麦角碱，筛选到来自日本曲霉的EasE和EasC这两个蛋白实现了裸麦角碱的合成，使得EasE和EasC在酵母异源中表达成为可能，关键酶EasE和EasC的研究依赖于真菌的基因互补，但进一步的表征则受到EasE蛋白表达困难的阻碍。最终发现EasE的N端ER靶向信号肽对在酵母中表达活性有影响，研究者对EasE信号肽做了截短验证，并没有将其他酶共同作细胞器定位尝试。研究者在酿酒酵母中实现了从头合成cycloclavine，裸麦角碱的一步下游产物，通过增加了三个拷贝数的DamW、四个拷贝数的EasC实现了cycloclavine产量为529mg/L，裸麦角碱产量为0.75mg/L，平行副产物羊茅麦角碱89mg/L，发酵优化发现低温22℃对EasE和EasC催化速率有明显提高使得chanoclavine
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I产量翻了十几倍。研究者发现在麦角生物碱合成路径中EasA是一个重要的分支控制点，序列比对发现EasA与黄素酶高度同源，EasA负责两个功能分别为异构化和还原性。研究者通过在大肠杆菌中表达获得可溶性蛋白EasG，体外通过控制还原性谷胱甘肽(GSH)的量与NADPH，裸麦角碱醛混合孵育，最终获得田麦角碱。在麦角生物碱合成路径中GSH替代了EasA的作用，对此说明EasA的具体催化机理或者说裸麦角碱醛到田麦角碱的催化机制依然是不清楚的。研究者又进一步解析了EasC的催化反应机制，EasC主要负责麦角生物碱中心碳环的生物合成，研究者提出自由基理论，解释了EasC的双功能——过氧化氢酶和单加氧酶功能。到目前为止，在异源宿主中进行合成田麦角碱的难度在于EasA酶的功能分配，还原性功能的表达将裸麦角碱醛流向羊茅麦角碱，已实现了89mg/L的滴度。研究者又在构巢曲霉中通过优化P450电子转移途径和CloA的拷贝数
实现了麦角酸的异源合成。研究者通过使用酶功能初始化
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酶相似度工具(EFI
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EST)，寻找途径酶(EasE、EasA和CloA)的同源基因在工程酿酒酵母中重建通路，最终在1L生物反应器中生产了滴度为1.7mg/L的麦角酸，其中它的重要前体田麦角碱的滴度只能达到2.8～3.1μg/L。
[0005]田麦角碱作为麦角生物碱合成路径上一个重要分支点走向的中间产物，对开发生物合成麦角酸衍生物系列占有举足轻重的地位，成功实现在工程酿酒酵母中合成麦角酸，将进一步证明在酿酒酵母中优化田麦角碱的产量具有巨大的潜力。在麦角生物碱中麦角酸衍生物是主要用于医药开发的一类，因此优化生物合成田麦角碱的高产对下游麦角生物碱的研究具有十分重要意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了高产田麦角碱重组酵母构建方法与应用。
[0007]本专利技术提供了高产田麦角碱重组酵母构建方法与应用。本专利技术确定了生物合成田麦角碱异源途径酶(DmaW，EasF，EasE，EasC，EasD，EasA，EasG)在酿酒酵母菌株中的亚细胞表达场以及表达水平，也进一步证明了该异源途径的引入会引起内源环境的辅因子不平衡，为后续继续优化提产田麦角碱提供了有利证据，也为以田麦角碱为前体生物合成麦角酸衍生物提供了一个高产底盘。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了如下任意项在合成田麦角碱中的应用；
[0010](I)、EasD，EasA和/或EasG定位到内质网上；和/或
[0011](II)、过表达POS5；和/或
[0012](III)、DmaW定位到内质网上；和/或
[0013](IV)、增加EasE和/或EasC的拷贝数；或
[0014](V)、增加DmaW、EasE和EasC拷贝数；或
[0015](VI)、插入Tat2，增加DmaW、EasE和EasC拷贝数；或
[0016](VII)、插入Tat2，DmaW定位到内质网上，增加DmaW、EasE和EasC拷贝数。
[0017]本专利技术还提供了组合元件，其包括共定位在内质网上的EasD，EasA和/或EasG。
[0018]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述共定位借助信号肽HDEL；所述信号肽置于EasD，EasA，EasG的C段。
[0019]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述组合元件还包括过表达的POS5。
[0020]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述组合元件还包括定位于内质网上的DmaW。
[0021]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述组合元件还包括独立增加拷贝数的DmaW，EasE和/或EasC。
[0022]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述组合元件还包括Tat2，且
[0023](I)、所述DmaW定位于内质网，且增加EasE和/或EasC的拷贝数；或
[0024](II)、增加DmaW、EasE和EasC拷贝数；或
[0025](III)、所述DmaW定位于内质网，且增加DmaW、EasE和EasC拷贝数。
[0026]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述DmaW的定位借助信号肽HDEL；所述信号肽置于DmaW的C段。
[0027]在上述研究的基础上，本专利技术还提供了质粒，包括所述组合元件。
[0028]本专利技术还提供了宿主，包括所述质粒。
[0029]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述宿主包括但不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.如下任意项在合成田麦角碱中的应用；(I)、EasD，EasA和/或EasG定位到内质网上；和/或(II)、过表达POS5；和/或(III)、DmaW定位到内质网上；和/或(IV)、增加EasE和/或EasC的拷贝数；或(V)、增加DmaW、EasE和EasC拷贝数；或(VI)、插入Tat2，增加DmaW、EasE和EasC拷贝数；或(VII)、插入Tat2，DmaW定位到内质网上，增加DmaW、EasE和EasC拷贝数。2.组合元件，其特征在于，其包括共定位在内质网上的EasD，EasA和/或EasG。3.如权利要求2所述的组合元件，其特征在于，其还包括过表达的POS5。4.如权利要求2或3所述的组合元件，其特征在于，还包括定位于内质网上的DmaW。5.如权利要求2至4任一项所述的组合元件，其特征在于，其还包括独立增...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，吴楠，杜现礼，王颖，姚明东，段小涛，肖文海，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：