一种亮氨酸脱氢酶突变体及其在生产L-2-氨基丁酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亮氨酸脱氢酶突变体及其在生产L

【技术实现步骤摘要】
一种亮氨酸脱氢酶突变体及其在生产L
‑2‑
氨基丁酸中的应用


[0001]本专利技术涉及一种亮氨酸脱氢酶突变体及其在生产L
‑2‑
氨基丁酸中的应用，属于酶工程和微生物工程


技术介绍

[0002]亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase，LeuDH，EC1.4.1.9)是一种辅酶NADH依赖型的氧化还原酶，它能将手性酮酸氢化还原生成对应的手性非天然氨基酸，并具有反应条件温和、产物光学纯和转化效率高等优点。1961年，Sanwal等人最先在Bacillus cereus中克隆和表达了亮氨酸脱氢酶，随后，对不同菌株来源的亮氨酸脱氢酶基因进行克隆和异源表达，可以为一些手性非天然氨基酸的生物合成提供更多途径。亮氨酸脱氢酶是一种常见的氧化还原酶，来源广泛。来源不同的两岸酸脱氢酶具有不同的催化性质和功能，通过基因工程手段构建高酶活菌株可以改善反应。
[0003]由2
‑
羰基丁酸钠催化来的L
‑2‑
氨基丁酸是一种重要的药物中间体，被广泛应用于医药、农业、化工等领域。其酰胺化制备得到的(S)
‑
2氨基丁酰胺，是抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦的关键前提，在市场上极具使用价值和应用场景。另外，通过L
‑2‑
氨基丁酸生产的(S)
‑2‑
氨基丁醇，是抗结合类药物丁醇的重要前体物质。可见其今后在市场上的需求巨大，因此急需更加高效且成本低的合成方法以满足市场需求。目前还未见对本专利技术申请的出发氨基酸—来源于微生物Exiguobacterium sibiricum的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)进行突变的相关报道。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供了一种催化活性提高的亮氨酸脱氢酶突变体，该突变体将出发氨基酸的第125位缬氨酸Val突变为蛋氨酸Met，相对于野生型亮氨酸脱氢酶的活性提高了55％，具体地，亮氨酸脱氢酶突变体V125M的酶活力达到33.33U
·
mg
‑1，而野生型亮氨酸脱氢酶的酶活力仅为21.50U
·
mg
‑1，因此，本专利技术的亮氨酸脱氢酶突变体在催化工艺中表现良好，具有工业应用价值。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶的第125位缬氨酸突变为蛋氨酸，得到亮氨酸脱氢酶突变体V125M。具体地，突变体V125M的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
[0007]进一步地，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的重组质粒。
[0009]进一步地，所述重组质粒的载体为pET
‑
28a(+)质粒、pET
‑
28b(+)质粒或pET
‑
20b(+)质粒。
[0010]本专利技术的第四个目的是提供表达所述亮氨酸脱氢酶突变体的宿主细胞。
[0011]进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
[0012]进一步地，所述细菌为大肠杆菌，优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
[0013]进一步地，本专利技术还提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0014](1)根据突变位点设计突变引物，以携带氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型亮氨酸脱氢酶编码基因的载体为模板进行定点突变，构建含编码亮氨酸脱氢酶突变体基因的表达载体；
[0015](2)将步骤(1)得到的含编码亮氨酸脱氢酶突变体基因的表达载体转化入宿主；
[0016](3)将上述表达亮氨酸脱氢酶突变体的宿主接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得上述亮氨酸脱氢酶突变体。
[0017]进一步地，在步骤(1)中，正向和反向突变引物为：
[0018]Val125
‑
F：5
’‑
TATTACCGCAGAAGACWYRAATACCACCGTTGCAG
‑3’
；
[0019]Val125
‑
R：5
’‑
CTGCAACGGTGGTATTYRWGTCTTCTGCGGTAATA
‑3’
。
[0020]进一步地，在步骤(1)中，在出发氨基酸LeuDH的三维结构模型以及保守性的基础上确定突变位点。
[0021]进一步地，在步骤(2)中，以pET28a(+)为载体制备得到重组质粒pET28a(+)
‑
LeuDH，以重组质粒pET28a(+)
‑
LeuDH为模板进行突变。
[0022]进一步地，在步骤(2)中，使用全质粒PCR方法对亮氨酸脱氢酶LeuDH进行突变。
[0023]进一步地，在步骤(2)中，将构建成功的突变体质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，在96孔板中挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养。
[0024]进一步地，在步骤(3)中，对活性表现最好的亮氨酸脱氢酶突变体离心处理菌液，用缓冲液重悬后进行超声破碎，通过镍离子亲和层析纯化得到亮氨酸脱氢酶突变体V125M。
[0025]本专利技术的第五个目的是提供上述亮氨酸脱氢酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在生产L
‑2‑
氨基丁酸中的应用。
[0026]进一步地，所述应用为以2
‑
羰基丁酸盐为底物，以所述亮氨酸脱氢酶突变体为催化剂催化转化生产L
‑2‑
氨基丁酸。
[0027]进一步地，具体地，将上述亮氨酸脱氢酶突变体添加至含有2
‑
羰基丁酸钠的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行提取，获得L
‑2‑
氨基丁酸。
[0028]进一步地，所述反应体系中还含有辅酶。
[0029]进一步地，所述辅酶为NADP
+
、NADPH、NAD
+
和NADH中的一种或几种。
[0030]进一步地，所述亮氨酸脱氢酶突变体在反应体系中的添加量为1～10kU/L。
[0031]进一步地，所述反应体系中，2
‑
羰基丁酸盐的浓度为20～1000mM。
[0032]进一步地，所述反应体系中，辅酶的浓度为0.01～1M。
[0033]进一步地，所述反应体系为含有2
‑
羰基丁酸钠、辅酶等的缓冲液。
[0034]进一步地，所述缓冲液为氯化铵氨水缓冲液。
[0035]进一步地，所述Tris
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于：所述的亮氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种编码权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种携带权利要求2或3所述的基因的重组质粒。5.一种表达权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体的宿主细胞。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。7.权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体、权利要求2或3...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗玮，王曾宇，鲁佳朋，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：