亚胺还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种亚胺还原酶突变体及其在(S)

【技术实现步骤摘要】
亚胺还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物催化领域，涉及对一种利用来源于粘球菌属的亚胺还原酶进行突变，并利用突变体为生物催化剂，以NADP(H)为辅酶，还原麦斯明(CAS:532
‑
12
‑
7)生成(S)
‑
去甲烟碱的方法，产物光学纯度>99％。

技术介绍

[0002](S)
‑
去甲烟碱，又名(S)
‑
降烟碱，英文名(S)
‑
(
‑
)
‑
Nornicotine，CAS号：494
‑
97
‑
3，分子式C9H12N2，结构式如下：
[0003][0004](S)
‑
去甲烟碱用于合成尼古丁疫苗中的尼古丁半抗原的前期研究以及治疗尼古丁上瘾的前期研究中，也是治疗帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和图雷特综合征方面的潜在的有益化合物前体[Viswanath A,Joseph L,[J]ACS Comb.Sci.2017,19,286
‑
298]。
[0005](S)
‑
去甲烟的合成方法主要包括化学法合成或生物酶催化法合成，使用化学法合成(S)
‑
去甲烟碱需要多步反应，过程中会用到手性衍生试剂或者金属催化剂等才能完成，条件苛刻，易造成环境污染，得到的产品光学纯度不高，难以达到98.0％以上，收率较低，在实际大规模生产中有诸多限制[Charles H.M.,Steven J.Q.[J]Journal of Medicinal Chemistry,2017,19,286
‑
298]。因此，探索更加绿色高效的生物酶催化法显得尤为重要。
[0006]生物催化合成(S)
‑
去甲烟的报道较少，2021年，Raymond McCague等利用来源的亚胺还原酶催化2
‑
吡啶
‑1‑
吡咯啉生成(S)
‑2‑
(3
‑
吡啶)
‑
吡咯烷还原生成(S)
‑
去甲烟碱，底物浓度达到0.4M/L(58.4g/L)，提高底物浓度，转化率明显下降[US 10913962.B2]。
[0007]由于胺类底物独特的性质，导致在还原过程中底物浓度往往不能过高，否则反应转化率会明显降低，昂贵辅酶的NAD(P)H的用量也较高，因此寻找更高活性，高底物耐受性的亚胺还原酶通成为了高效还原亚胺底物2
‑
吡啶
‑1‑
吡咯啉生成(S)
‑
去甲烟碱的关键因素。

技术实现思路

[0008]为了在温和的反应条件下高效合成(S)
‑
去甲烟碱，本专利技术对来源于Myxococcus fulvus的亚胺还原酶MfIR(WP_074958336.1)进行定向进化，获得酶活力及底物耐受提高的亚胺还原酶突变体，对亚胺进行还原从而制备高手性纯度的(S)
‑2‑
(3
‑
吡啶)
‑
吡咯烷。
[0009]本专利技术第一方面提供一种合成高手性纯度的(S)
‑
去甲烟碱的方法，利用工程化改造后的亚胺还原酶作为催化剂，改造后的亚胺还原酶与SEQ ID NO.1具有至少90％同一性，且所述的突变体转化产物(S)
‑
去甲烟碱的ee值>99％。
[0010]另一方面提供的亚胺还原酶突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突
变蛋白是在对应于SEQ ID NO.1:1
‑
291中的位点65，123和212在内的一个或多个位点突变的亚胺还原酶突变体：
[0011]在另一优选例中，所述的第65位天冬酰胺(N)突变为缬氨酸(V)、脯氨酸(P)，优选缬氨酸(V)。
[0012]在另一优选例中，所述的第123位苏氨酸突变为脯氨酸(P)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)，优选脯氨酸(P)。
[0013]在另一优选例中，第212位甲硫氨酸(M)突变为缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)，优选异亮氨酸(I)。
[0014]更具体的是下述组合突变：第65位突变为缬氨酸(V)且第212位突变为亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；第123位突变为脯氨酸(P)、酪氨酸(Y)且第212位突变为亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
[0015]第三方面，第二方面所述的亚胺还原酶突变体催化如下反应：具体地，所述催化反应以含亚胺还原酶突变体编码基因工程菌经发酵后的培养物、菌体细胞或破碎液作为催化剂，以麦斯明为底物，以NADP(H)为辅酶，以pH为6.0
‑
10.0的缓冲液为反应介质，在25℃
‑
50℃、搅拌条件下进行还原反应；
[0016]所述反应具有选自下组的一个或多个特点：
[0017](i)反应体系含有菌体量为10
‑
50g/L，更佳地，10
‑
30g/L；
[0018](ii)反应体系的pH为6.0
‑
10.0，较佳地，6.0
‑
8.0，更佳地，7.5；
[0019](iii)反应体系温度为20℃
‑
50℃，较佳地，20℃
‑
30℃，更佳地，25℃。
[0020](iv)催化底物浓度为5
‑
150g/L，更佳地，底物浓度为80
‑
130g/L；
[0021](v)催化获得的(S)
‑
去甲烟碱的ee值≥99.0％。
附图说明
[0022]图1显示了MfIR与突变体蛋白经诱导表达后结果。其中，M表示Marker，1为野生型MsIR1可溶蛋白表达，2
‑
6为代表性突变体可溶蛋白表达。
[0023]图2产物去甲烟碱消旋体的HPLC谱图。
[0024]图3(S)
‑
去甲烟碱的HPLC谱图。
具体实施方式
[0025]下面的实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。
[0026]如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如N65V表示第65位的氨基酸N突变为V，以此类推。
[0027]在本专利技术的一优选实施方式中，本专利技术的亚胺还原酶突变体的制备方法如下：大肠杆菌作为表达宿主。具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)亚胺还原酶MsIR1相应突变位点的基因构建到pET 28a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞，优选大肠杆菌BL21(DE3)，获得相应的工程菌株。(3)将工程菌株接种至种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚胺还原酶突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白在对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第65位点的谷氨酰胺突变为缬氨酸；第123位点的苏氨酸突变为脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸；第212位点的甲硫氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。2.一种亚胺还原酶突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白在对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列存在如下位点的突变：第123位突变为脯氨酸或酪氨酸且第212位突变为亮氨酸或异亮氨酸。3.如权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变蛋白的编码基因。4.含有如权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变蛋白的编码基因的表达载体。5.含有如权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变蛋白的编码基因的重组细胞。6.如权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变蛋白在制备手性(S)
‑
去甲烟碱中的应用7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是以麦斯明(CAS:532
‑
12
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7)为底物催化反应合成(S)
‑
去甲烟碱。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李键煚，刘祥涛，徐泽菲，姚培圆，陈曦，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：