一种热稳定亮氨酸脱氢酶的应用及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种热稳定亮氨酸脱氢酶的应用及其制备方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术中公开了的三种亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如：SEQ ID NO.1～3所示。这三种亮氨酸脱氢酶具有优异的温度适应范围、较广的pH的适应范围，在最适温度70℃下的半衰期高达30h左右，这三种酶可应用于高温条件下的氧化脱氨反应或还原胺化反应中。而且利用原核表达的这三种酶具有较高的纯度与生物学活性可以用于制备L

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定亮氨酸脱氢酶的应用及其制备方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种热稳定亮氨酸脱氢酶的应用及其制备方法。

技术介绍

[0002]亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase)属于氨基酸脱氢酶家族，以NAD(H)为辅助因子，催化支链L
‑
氨基酸的氧化脱氨和相应α
‑
酮酸的可逆还原胺化。得益于测序和数据库技术的深度发展，越来越多的亮氨酸脱氢酶序列得到鉴定，从NCBI数据库中的检索结果来看，总来源高达16万种，广泛分布于各种生物体中。
[0003]此外，亮氨酸脱氢酶具有十分广泛的应用，特别是在活性医药中间体的酶促不对称合成方面，如L
‑
叔亮氨酸、L
‑2‑
氨基丁酸、L
‑
苯甘氨酸等。其中，L
‑
叔亮氨酸它是众多活性药物的前体，例如：HIV蛋白酶抑制剂(阿扎那韦)、肽脱甲酰酶抑制剂(BB
‑
83698)等；L
‑2‑
氨基丁酸制备抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦的关键前体；L
‑
苯甘氨酸被用作半合成广谱抗生素和L
‑
氯吡格雷的基本成分，后者是动脉粥样硬化患者的抗血栓形成剂。
[0004]尽管亮氨酸脱氢酶有着广泛的应用，然而亮氨酸脱氢酶在实际生产应用条件中常面临高温、高活性的核心要求，许多亮氨酸脱氢酶不能在热稳定和高酶活二者间取得良好的平衡。因此，寻找各方面酶学性质都比较均衡的亮氨酸脱氢酶，无论是从实际工业应用的合理性角度，还是经济性上来看，都是十分有意义的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种具有热稳定性的亮氨酸脱氢酶的制备方法与应用。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种将热稳定亮氨酸脱氢酶应用于30～80℃的条件下的化脱氨反应或还原胺化反应中的应用；
[0008]所述热稳定亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0009]所述氧化脱氨反应是指亮氨酸脱氢酶以NAD
+
为辅酶催化氨基酸的氧化脱氨反应，伴随NADH的生成。
[0010]优选的，所述氨基酸包括：L
‑
亮氨酸、L
‑
异亮氨酸、L
‑
缬氨酸、L
‑
甲硫氨酸、L
‑
叔亮氨酸以及L
‑
半胱氨酸。
[0011]所述还原胺化反应是指亮氨酸脱氢酶以NADH为辅酶催化酮酸的还原胺化反应，伴随NADH的消耗。
[0012]优选的，所述酮酸包括：三甲基丙酮酸、4
‑
甲基
‑2‑
氧代戊酸、2
‑
氧代丁酸、2
‑
氧代戊酸、4
‑
羟苯基丙酮酸以及苯乙醛酸。
[0013]本专利技术还提供了一种生产L
‑
叔亮氨酸的方法；具体的来说就是以三甲基丙酮酸为底物，利用上述的热稳定亮氨酸脱氢酶与谷氨酸脱氢酶在40℃，pH9.5的条件下催化合成L
‑
叔亮氨酸。
[0014]另一方面，本专利技术还提供了一种热稳定亮氨酸脱氢酶的制备方法，包含以下步骤：
[0015]步骤一：获取编码上述的热稳定亮氨酸脱氢酶的基因，将其连接至克隆载体，得到重组质粒；
[0016]步骤二：制备包含质粒表达载体的工程菌；
[0017]步骤三：酶的原核表达以及分离、纯化，得到热稳定亮氨酸脱氢酶。
[0018]优选的，步骤一中所述的克隆载体为pET28a质粒。
[0019]优选的，步骤二中所述的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0020]另一方面，本专利技术还提供了一种按照上述方法制备得到的热稳定亮氨酸脱氢酶。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022](1)本专利技术提供了与目前已知不同来源的三种新型亮氨酸脱氢酶，通过对其酶学性质的测定发现，这三种酶具有优异的温度适应范围，在30℃
‑
80℃均展现出活性，与此同时在最适温度70℃下的半衰期高达30h左右；此外，在70℃下测定了这三种酶对六种酮酸底物的活性，也是展现处理良好的活性；而且，还有着较广的pH的适应范围。
[0023](2)本专利技术还提供了制备这三种亮氨酸脱氢酶的方法，通过该方法制备得到的亮氨酸脱氢酶纯度高且具有良好的生物学活性。
[0024](3)本专利技术还提供了一种利用本申请中的三种亮氨酸脱氢酶制备L
‑
叔亮氨酸的方法，依照本方法制备得到的L
‑
叔亮氨酸产率高、纯度高。
附图说明
[0025]图1：探针和推测的亮氨酸脱氢酶的进化树。进化树是用MEGA
‑
X软件和最大似然法构建。
[0026]图2：三种亮氨酸脱氢酶SDS
‑
PAGE分析，M：Marker；1：PgLeuDH粗酶液；2：PgLeuDH纯化蛋白；3：PfLeuDH粗酶液；4：PfLeuDH纯化蛋白；5：UtLeuDH粗酶液；6：UtLeuDH纯化蛋白(目的蛋白的分子量如下：PgLeuDH:40.02kDa；PfLeuDH：40.30kDa；UtLeuDH：40.70kDa)。
[0027]图3：三种亮氨酸脱氢酶最适温度、最适pH，A：还原胺化最适pH；B：氧化脱氨最适pH；C：还原胺化最适温度；D：氧化脱氨最适温度。
具体实施方式
[0028]考虑到亮氨酸脱氢酶在实际生产应用条件中常面临高温、高活性的核心要求，许多亮氨酸脱氢酶不能在热稳定和高酶活二者间取得良好的平衡。为了解决上述问题，本专利技术通过基因挖掘的方法，筛选出兼备优异热稳定性、高活性、pH适应范围的新型优质亮氨酸脱氢酶，以满足工业应用的实际需求同经济性。
[0029]本专利技术提供了一种将热稳定亮氨酸脱氢酶应用于30～80℃的条件下的氧化脱氨反应或还原胺化反应中的应用；
[0030]优选的，所述将热稳定亮氨酸脱氢酶应用于60～80℃的条件下的氧化脱氨反应或还原胺化反应中的应用；
[0031]优选的，所述热稳定亮氨酸脱氢酶的最适温度为70℃。
[0032]亮氨酸脱氢酶的基因挖掘：
[0033]首先，通过文献调研综合对比，选择一株热稳定和活性均较为优秀的LeuDH作为模板探针(来源于Planifilum fimeticola，GenBank accession number:WP_106345646.1)利用BLAST功能检索潜在的新型亮氨酸脱氢酶，跟据BLAST的分析结果，从同源性区间为100
‑
90％、90
‑
80％、80
‑
70％(包括Probe)的结果中分别选取10条潜在亮氨酸脱氢酶蛋白序列。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定亮氨酸脱氢酶的应用，其特征在于，将所述亮氨酸脱氢酶应用于30～80℃的条件下的氧化脱氨反应或还原胺化反应中；所述热稳定亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氧化脱氨反应是指亮氨酸脱氢酶以NAD
+
为辅酶催化氨基酸的氧化脱氨反应，伴随NADH的生成。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述还原胺化反应是指亮氨酸脱氢酶以NADH为辅酶催化酮酸的还原胺化反应，伴随NADH的消耗。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氨基酸包括：L
‑
亮氨酸、L
‑
异亮氨酸、L
‑
缬氨酸、L
‑
甲硫氨酸、L
‑
叔亮氨酸以及L
‑
半胱氨酸。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酮酸包括：三甲基丙酮酸、4
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：敬科举，胡敏，黄晓婷，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：