用于治疗尼古丁依赖的产品和方法技术

本公开提供了尼古丁氧化还原酶的变体和选择此类变体的方法，以及其分解代谢活性片段，所述变体在通过使用氧作为电子受体的氧化对尼古丁进行分解代谢破坏中具有意想不到的活性。还公开了包含CycN细胞色素c蛋白和变体尼古丁氧化还原酶全酶、其片段或天然存在的尼古丁氧化还原酶中的至少一者的组合物，以及包含催化活性尼古丁氧化还原酶片段或全酶和CycN细胞色素c片段或全酶的融合蛋白。此外，提供了L

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗尼古丁依赖的产品和方法
[0001]以电子方式递交的材料通过引用并入
[0002]本申请含有作为本公开的单独部分的计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用整体并入并且标识如下：文件名：55531A_Seqlisting.txt；大小：551,717字节；创建于：2020年5月28日。


[0003]本公开整体涉及医学和分子生理学领域，并且更具体地涉及与成瘾性依赖相关的材料和方法。

技术介绍

[0004]抗癌进展缓慢得令人沮丧。烟草摄入是最重要的可预防的癌症原因。此外，吸烟不仅导致癌症，而且还引发许多其他心血管和肺部问题。这使得烟草摄入成为世界范围内的疾病和可预防死亡的主要原因。
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目前，美国每年有五分之一(约480,000)的死亡是由吸烟造成的。
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吸烟者意识到了这种风险，并且其中约70％的人希望戒烟。3在现实中，只有一小部分吸烟者成功戒烟。
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推动烟草摄入的主要物质尼古丁的成瘾能力未被充分认识，67％的尝试一支香烟的人们成为每日吸烟者。
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[0005]黄素依赖酶利用它们的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黄素单核苷酸辅因子进行还原
‑
氧化化学。这些酶能够在单电子或双电子转移反应中在它们的辅因子与底物之间传递电子1。一些黄素酶，称为氧化酶，将黄素结合的电子快速递送至分子氧(O2)，从而产生作为副产物的活性氧物质，诸如超氧化物或过氧化氢。其他黄素酶对其客户更加挑剔，优选为特定的蛋白质或小分子底物提供电子。这些被称为脱氢酶，并且通常不与分子氧快速反应。然而，由于黄素辅因子与O2的固有反应性和氧的强氧化性氧化还原电位，在有氧环境中，在大多数黄素依赖酶中一定程度的氧反应性是不可避免的。含黄素胺氧化酶(pfam：01593)2在接受来自其含胺底物的电子后被O2快速再氧化。至少在体外，这种快速再氧化对于该酶家族的几乎所有先前表征成员都是明显的3‑5。然而，尼古丁氧化还原酶(NicA2)似乎违背了这一传统观点。
[0006]近期，尝试了一种治疗尼古丁依赖的酶方法，但是其并未表现出将在现实世界中可用于治疗人尼古丁成瘾的治疗的药代动力学和药效动力学特性。近期的两项独立的临床前研究揭示，将来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)S16(一种利用尼古丁作为其主要碳源和氮源的生物体
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)的NicA2酶腹膜内注射到尼古丁依赖的大鼠体内在很大程度上消除了血液中的尼古丁，逆转了尼古丁戒断的症状并消除了强迫性尼古丁摄入
11，13
。在该动物模型中，NicA2治疗还降低了戒除后复发的易感性。由于戒断症状的避免是维持尼古丁成瘾的关键因素之一
14，35
，这些发现具有重要的临床意义。
[0007]NicA2是一种FAD依赖酶，其具有催化尼古丁氧化为N
‑
甲基麦斯明(N
‑
methylmyosmine)的特殊能力6。它是从恶臭假单胞菌S16中分离的，这是一种具有非常不寻常的利用尼古丁作为其唯一碳源和氮源快速生长的能力的微生物7。NicA2催化该分解代谢
途径中的第一步，最终导致产生富马酸盐以用于生物体的中央代谢8。NicA2的FAD辅因子接受来自尼古丁的氢化物，在酶的生物学上重要的半反应中将其转化为N
‑
甲基麦斯明9。接着，N
‑
甲基麦斯明自发水解为假氧基尼古丁(pseudooxynicotine)，其在动物模型中无毒且无成瘾性
10
。
[0008]然而，在人的烟草中断疗法中有效使用NicA2的主要障碍是NicA2酶在所用条件下的酶活性非常低。体外研究表明，利用氧作为电子受体将尼古丁转化为假氧基尼古丁的过程极其缓慢，k
cat
为0.007/秒。
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这是缓慢的，不仅对于这类黄素依赖性氧化酶，而且对于一般的酶都是如此。催化相关反应的NicA2的同系物以高最多至10,000倍的转换速率(turnover rate)起作用。
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NicA2的低催化速率需要每天向大鼠注射10mg/kg的酶以逆转其尼古丁依赖，这超过酶底物的330倍。
35
对一个70kg的人来说，每天0.7克酶的当量剂量是不切实际的。
[0009]因此，本领域仍然需要治疗尼古丁依赖的疗法，诸如酶疗法，但是尼古丁降解酶诸如尼古丁氧化还原酶在尼古丁降解中表现出的动力学缓慢得不切实际，从而突显了对在降解尼古丁方面具有足够的活性以提供治疗益处的治疗尼古丁依赖的酶疗法的需要。

技术实现思路

[0010]本公开提供了开辟基于酶的方法来治疗尼古丁依赖的产品和方法。尼古丁氧化还原酶是一种降解尼古丁的主要含黄素酶，其不使用O2作为电子受体，这一令人惊讶的发现与含黄素酶使用O2作为电子受体的传统观点相反。通过包括使用O2作为电子受体的尼古丁氧化还原酶的途径对尼古丁进行氧化降解的动力学如此缓慢，以至于本领域已经转向其他方向来寻找治疗尼古丁依赖的方法。本文公开的发现是，通过将尼古丁氧化还原酶偶联至被称为CycN细胞色素c的细胞色素c蛋白形式的意想不到的电子供体，通过所述酶催化的氧化还原反应的动力学得到显著改善。甚至更令人惊讶的是对尼古丁氧化还原酶进行修饰以代替细胞色素c蛋白使用O2(一种廉价且普遍存在的电子受体)的定向进化工作，其具有与治疗尼古丁依赖的方法相容的动力学。与这种方法一致，本文公开了大约100种NicA2尼古丁氧化还原酶变体，相对于SEQ ID NO：131的野生型NicA2酶，所述变体表现出明显改善的尼古丁催化动力学。大量能够在生理水平上使用O2作为电子受体的NicA2尼古丁氧化还原酶变体跨越NicA2尼古丁氧化还原酶的全长，并且总的来说，这些变体完全表征了使用O2作为电子受体的NicA2尼古丁氧化还原酶变体的组或属。这些变体及其药理学活性片段以及编码此类变体和片段的多核苷酸可用作治疗尼古丁依赖的治疗剂，如下文更详细地公开的。NicA2尼古丁氧化还原酶变体片段包括由全长基因编码的缺乏大约37个残基的信号序列的NicA2尼古丁氧化还原酶的片段以及具有截短的N末端的片段。
[0011]扩展这种治疗尼古丁依赖的基于酶的方法，本公开还揭示，与尼古丁氧化还原酶类似的含黄素酶，诸如L
‑6‑
羟基尼古丁氧化酶(LHNO)，可以被修饰成不转移电子受体，而是转移电子供体，即，所述化合物被氧化降解。天然LHNO使用O2作为电子受体来催化L
‑6‑
羟基尼古丁氧化降解为L
‑6‑
羟基假尼古丁。产生LHNO变体以将底物需求从L
‑6‑
羟基尼古丁转变为尼古丁，同时保留使用O2作为电子受体的能力，也可以与治疗尼古丁依赖的方法相容的动力学使用。
[0012]本公开还提供了筛选方法，包括高通量筛选方法，以鉴定可用于以O2为电子受体
降解尼古丁的尼古丁氧化还原酶变体和L
‑6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种NicA2尼古丁氧化还原酶变体或其功能片段，其包含与SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列相比具有少于10个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列，其中对于以氧为电子受体氧化尼古丁而言，与SEQ ID NO：131的野生型NicA2尼古丁氧化酶相比，所述NicA2尼古丁氧化还原酶变体表现出更高的K
M
和/或更高的K
cat。
2.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体或其功能片段，其包含与SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列相比具有1个氨基酸取代的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体包含在位置12、29、37、39、42、44、45、46、48、49、50、51、52、54、59、62、63、69、72、73、75、78、85、92、93、94、96、98、99、100、103、104、107、108、112、114、115、120、127、129、130、131、132、133、135、137、138、145、146、147、151、152、156、157、159、160、161、168、171、172、173、174、177、180、183、184、187、188、191、192、196、198、199、202、209、210、213、215、217、221、222、223、224、225、229、231、235、239、242、243、244、245、246、249、253、258、260、265、267、270、276、277、278、280、281、282、287、291、292、293、295、296、298、302、303、306、307、308、311、314、317、319、324、330、331、333、335、337、338、345、349、351、355、357、359、364、366、368、371、373、374、379、380、381、382、388、389、390、393、394、395、398、403、406、408、411、418、421、424、426、427、429、431、432、435、437、441、442、443、444、449、454、455、457、460、461、462、473、474、476、480、481、482、483和/或484中的一个或多个处不同于SEQ ID NO：131的野生型序列的氨基酸序列。4.如权利要求3所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体包含成熟的NicA2尼古丁氧化还原酶，所述成熟的NicA2尼古丁氧化还原酶包含在位置42、44、45、46、48、49、50、51、52、54、59、62、63、69、72、73、75、78、85、92、93、94、96、98、99、100、103、104、107、108、112、114、115、120、127、129、130、131、132、133、135、137、138、145、146、147、151、152、156、157、159、160、161、168、171、172、173、174、177、180、183、184、187、188、191、192、196、198、199、202、209、210、213、215、217、221、222、223、224、225、229、231、235、239、242、243、244、245、246、249、253、258、260、265、267、270、276、277、278、280、281、282、287、291、292、293、295、296、298、302、303、306、307、308、311、314、317、319、324、330、331、333、335、337、338、345、349、351、355、357、359、364、366、368、371、373、374、379、380、381、382、388、389、390、393、394、395、398、403、406、408、411、418、421、424、426、427、429、431、432、435、437、441、442、443、444、449、454、455、457、460、461、462、473、474、476、480、481、482、483和/或484中的一个或多个处不同于SEQ ID NO：131的野生型序列的氨基酸序列。5.如权利要求3所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体包含在位置93、104、107、108、130、132、249、317、368、379、381、427或462中的一个或多个处不同于SEQ ID NO：131的野生型序列的氨基酸序列。6.如权利要求4所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体包含以下氨基酸取代：位置12处的丝氨酸取代异亮氨酸(S12I)、G29S、S37N、T39S、T42A、R44H、A45T、A45V、S46R、V48A、K49N、G50A、G50C、G50D、G50S、G51S、F52L、Y54F、V59I、G62S、F63L、F63V、A69V、C72S、G73S、Q75H、R78G、R78H、R85C、R85H、T92A、T92I、T92S、F93L、T94A、R96H、R96S、A98E、A98S、G99D、Q100H、E103D、F104I、F104L、A107P、A107T、W108R、L112M、L112Q、P114Q、H115Y、M120I、V127M、E129Q、E129V、D130A、D130E、D130G、D130N、D130S、D130V、D130Y、P131Q、
P131S、L132R、T133I、L135M、K137R、T138I、G145A、S146G、S146I、V147F、V147L、S151I、P152S、G156C、G156D、G156S、K157M、K157R、I159V、R160H、I161F、1161V、H168Q、W171C、W171R、E172G、V173A、F174C、F174I、F174V、P177L、P180L、T183I、E184G、E184K、R187L、E188D、K19lM、K191N、S192C、S192I、S192N、D196H、I198F、K199R、G202D、A209T、Q210H、S213T、M215L、L217P、E221D、T222S、T223N、D224E、K225N、K225Q、P229L、V231I、F235I、F235L、G239A、Y242N、D243N、A244V、F245Y、M246T、E249G、R253S、T258A、G260A、G260S、M265I、T267I、T267S、G270C、S276C、S276N、V277I、P278Q、P278S、T280K、A281T、V282I、G287D、1291V、K292N、K292Q、K292R、T293S、D295N、D295V、D296E、1298F、1298V、G302A、V303A、M306V、T307P、V308L、N311S、K314Q、G317D、G317S、T319I、K324E、1330T、K331N、G333S、L335V、K337M、G338S、V345L、L349M、R351H、F355L、D357E、Q359L、Q359E、Q359R、W364C、Q366K、Q366R、H368L、H368P、H368R、H368Y、S371R、E373K、L374M、S379N、I380V、T381I、T381S、I382V、I388F、D389E、V390I、R393C、D394N、A395V、R398L、M403I、G406D、E408D、G411D、G411S、T418S、P421L、L424Q、A426T、W427L、A429V、G431D、G431S、V432M、L435Q、R437H、L441M、Q442H、A443V、A444G、L449V、E454D、T455A、N457T、H460L、A461V、N462S、A473V、G474S、E476V、L480P、L481A、L481P、S482E、483L和/或484I。7.如权利要求2所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体包含SEQ ID NO：20
‑
119中的任一个所示的序列。8.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体的片段，其中所述片段在对应于SEQ ID NO：131的位置93、104、107、108、130、132、249、317、368、379、381、427或462的位置处包含变体氨基酸。9.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体的K
M
大于0114。10.如权利要求9所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体的K
M
为至少1.5。11.如权利要求10所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体的K
M
为1.5
‑
29。12.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体的K
cat
大于0.007。13.如权利要求12所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体的K
cat
为至少0132。14.如权利要求13所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体的Kcat为0.132
‑
0.314。15.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其包含与SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列相比具有1个氨基酸缺失的氨基酸序列。16.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其包含与SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列相比具有1个氨基酸添加的氨基酸序列。17.如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体，其中所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性。18.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的NicA2尼古丁氧化还原酶变体。19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中所编码的NicA2尼古丁氧化还原酶变体相对于SEQ ID NO：130的野生型nic...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：西密歇根大学董事会，
类型：发明
国别省市：