缬氨酸脱氢酶及其突变体在制备手性L-氨基酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了缬氨酸脱氢酶及其突变体在制备手性L

【技术实现步骤摘要】
缬氨酸脱氢酶及其突变体在制备手性L
‑
氨基酸中的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
更具体地，涉及缬氨酸脱氢酶及其突变体在制备手性L
‑
氨基酸中的应用。

技术介绍

[0002]氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.X)是一类以NAD(H)或NADP(H)为辅酶，可逆的催化α
‑
酮酸还原胺化生成对应氨基酸的氧化还原酶。氨基酸脱氢酶催化酮酸的还原胺化反应，以NH3作为氨基供体，热力学上反应平衡倾向于氨基酸生成的方向，从原子经济性的角度来看具有极大优越性，在非天然手性氨基酸的胞外酶催化制备或胞内生物合成领域受到广泛关注。同时，氨基酸脱氢酶也可通过分子改造技术转变为胺脱氢酶，应用于手性胺或手性胺醇等高值手性化合物的合成(陈飞飞,汪东浩,许建和,等.胺脱氢酶催化合成手性胺的机遇与挑战[J].生物加工过程,2020,18(1):10.)。
[0003]缬氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.8)是氨基酸脱氢酶家族的一员，以缬氨酸或对应酮酸作为其天然底物。相较于与研究较多且同为Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶亚家族的亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶，已报道的缬氨酸脱氢酶非常少，极大限制了缬氨酸脱氢酶的实际应用。缬氨酸脱氢酶表现出独特的底物偏好性，是开发新型手性氨基酸与手性胺合成用酶催化剂的重要素材，新型缬氨酸脱氢酶的挖掘与改造具有重要的科学研究价值与实际应用前景。
[0004]热泉作为一种极端的生态环境，孕育了许多独特的生命形式，是发现新型酶催化剂的重要资源。但是，热泉中的多数微生物都是不能被培养或难培养的，采用传统的基于微生物培养的酶催化剂挖掘手段会导致大部分潜在新颖酶催化剂被遗漏。采用宏基因组酶挖掘技术对热泉宏基因组进行挖掘，有望获得新的缬氨酸脱氢酶，为高值非天然手性氨基酸的生物催化合成提供新的、高效酶催化剂。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种缬氨酸脱氢酶
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种缬氨酸脱氢酶突变体。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供所述缬氨酸脱氢酶或所述缬氨酸脱氢酶突变体在制备手性L
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氨基酸中的应用。
[0008]本专利技术的第四个目的是提供一种制备手性L
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氨基酸的方法。
[0009]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0010]本专利技术通过对云南热泉(pH 3，75.3℃)沉积物的宏基因组测序数据进行基因功能预测，并以现有的缬氨酸脱氢酶的氨基酸序列(NCBI ID：Q53872.1)作为探针，从热泉宏基因组中获得了一个与探针氨基酸序列一致性为46％的新的缬氨酸脱氢酶，命名为HsVDH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码HsVDH的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]基于所获得的缬氨酸脱氢酶HsVDH，本专利技术通过定向点突变还获得了其突变体，所
述突变体是由SEQ ID NO.3所示缬氨酸脱氢酶氨基酸序列的第294位异亮氨酸定点突变为缬氨酸或丙氨酸得到，利用该缬氨酸脱氢酶或其突变体可制备得到手性L
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氨基酸，对高值非天然手性氨基酸的生物催化合成具有重要意义。
[0012]本专利技术提供了一种缬氨酸脱氢酶，所述缬氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]本专利技术还提供了一种编码上述缬氨酸脱氢酶的基因。
[0014]具体地，所述编码缬氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]为便于将所述缬氨酸脱氢酶在大肠杆菌表达系统中顺利地功能表达，本专利技术对SEQ ID NO.1所示基因进行了密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]本专利技术还提供了一种缬氨酸脱氢酶突变体，所述突变体是由SEQ ID NO.3所示缬氨酸脱氢酶氨基酸序列的第294位异亮氨酸定点突变为缬氨酸或丙氨酸得到。
[0017]具体地，当第294位异亮氨酸定点突变为缬氨酸时，所述缬氨酸脱氢酶突变体(I294V)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]具体地，当第294位异亮氨酸定点突变为丙氨酸时，所述缬氨酸脱氢酶突变体(I294A)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0019]鉴于本专利技术所述缬氨酸脱氢酶和缬氨酸脱氢酶突变体可用于制备手性L
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氨基酸。因此，本专利技术还申请保护所述缬氨酸脱氢酶或缬氨酸脱氢酶突变体在制备手性L
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氨基酸中的应用。
[0020]基于本专利技术所述缬氨酸脱氢酶或缬氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列，本领域技术人员可以获得可编码所述缬氨酸脱氢酶或缬氨酸脱氢酶突变体的基因，进而通过基因工程技术手段获得重组缬氨酸脱氢酶或缬氨酸脱氢酶突变体。因此，编码本专利技术所述缬氨酸脱氢酶和缬氨酸脱氢酶突变体的基因、含有编码本专利技术所述缬氨酸脱氢酶和缬氨酸脱氢酶突变体的基因的重组表达载体或能表达本专利技术所述缬氨酸脱氢酶和缬氨酸脱氢酶突变体的基因工程菌或细胞在制备手性L
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氨基酸中的应用也应在本专利技术的保护范围内。
[0021]具体地，所述缬氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述缬氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
[0022]具体地，所述手性L
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氨基酸为L
‑2‑
氨基丁酸、L
‑
叔亮氨酸或L
‑
苯甘氨酸。
[0023]本专利技术还提供了一种利用本专利技术所述缬氨酸脱氢酶或缬氨酸脱氢酶突变体制备手性L
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氨基酸的方法，所述方法为：制备本专利技术所述缬氨酸脱氢酶或所述缬氨酸脱氢酶突变体的酶液，将制备所得酶液或将能表达所述缬氨酸脱氢酶或所述缬氨酸脱氢酶突变体的转基因工程菌细胞加入含有α
‑
酮酸底物、氨基供体及辅酶再生系统的混合体系中进行还原胺化反应，制得手性L
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氨基酸。
[0024]具体地，所述酶液为能表达所述缬氨酸脱氢酶或所述缬氨酸脱氢酶突变体的基因工程菌的破胞粗酶液或纯化后的酶液。
[0025]具体地，所述缬氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述缬氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
[0026]具体地，所述α
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酮酸底物为2
‑
丁酮酸、3,3
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二甲基
‑2‑
氧代丁酸、苯乙酮酸或其各自的盐形式化合物。
[0027]具体地，所述手性L
‑
氨基酸为L
‑2‑
氨基丁酸、L
‑
叔亮氨酸或L
‑
苯甘氨酸。
[0028]具体地，所述辅酶再生系统为以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶，以甲酸铵为辅酶再生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种缬氨酸脱氢酶，其特征在于，所述缬氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种缬氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体是由SEQ ID NO.3所示缬氨酸脱氢酶氨基酸序列的第294位异亮氨酸定点突变为缬氨酸或丙氨酸得到。3.权利要求1所述缬氨酸脱氢酶或权利要求2所述缬氨酸脱氢酶突变体在制备手性L
‑
氨基酸中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述手性L
‑
氨基酸为L
‑2‑
氨基丁酸、L
‑
叔亮氨酸或L
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苯甘氨酸。5.一种制备手性L
‑
氨基酸的方法，其特征在于，所述方法为：制备权利要求1所述缬氨酸脱氢酶或权利要求2所述缬氨酸脱氢酶突变体的酶液，将制备所得酶液或将能表达权利要求1所述缬氨酸脱氢酶或权利要求2所述缬氨酸脱氢酶突变体的转基因工程菌细胞加入含有α
‑
酮酸底物、氨基供体及辅酶再生系统的混合体系中进行还原胺化反应，制得手性L
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氨基酸。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述酶液为能表达权利要求1所述缬氨酸脱氢酶或...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹新坚，龚文忠，高志增，刘岚，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：