一种检测人类β-地中海贫血基因分型的核酸组合及试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人类β

【技术实现步骤摘要】
一种检测人类
β
‑
地中海贫血基因分型的核酸组合及试剂盒与应用


[0001]本专利技术涉及体外诊断基因检测领域，具体而言，涉及一种检测人类β
‑
地中海贫血基因分型的核酸组合及试剂盒与应用。

技术介绍

[0002]β地中海贫血是一种高发于中国南方十省等地区的常染色体隐性遗传病，由于β
‑
珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的溶血性贫血。β
‑
珠蛋白基因突变以点突变为主，少数为缺失型。中国目前至少已报道84种β
‑
珠蛋白基因点突变和11种β
‑
珠蛋白基因缺失。其中，6种点突变：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.
‑
78A>G，HBB：c.79G>A，HBB：c.316
‑
197C>T和HBB：c.216_217insA占了全部突变类型的90％以上。
[0003]β
‑
地贫的临床表型可分为4种：(1)静止型β
‑
地贫，基因型为β
++
/β
N
，血液学表型正常或临界，一般只能通过分子诊断识别；(2)轻型β
‑
地贫，基因型为β0/β
N
或β
+
/β
N
，临床表现为小细胞低色素和HbA2值升高；(3)中间型β
‑
地贫，基因型为β
+
/β
+
或β
+
/β0，表型变异范围大，可从轻度贫血到中度贫血，多于幼儿期出现中度贫血；(4)重型β
‑
地贫，基因型为β
+
/β0或β0/β0，通常伴有严重贫血，需要定期输血才能存活。患儿出生时无症状，常于婴儿期(3
‑
12月龄)发病。如不治疗，患儿多于5岁前死亡。此外，中间型的分子基础较为复杂，显性β
‑
地贫突变的杂合子(β
D
/β
N
)，合并α
‑
地贫突变的β
‑
地贫突变纯合子(β0/β0)，或合并α
‑
珠蛋白三联体的β
‑
地贫突变杂合子(β0/β
N
或β
+
/β
N
)，也会显示中间型的表型。
[0004]β地中海贫血目前尚无法治愈，输血和骨髓移植可改善患者生活质量，但给患者和家庭带来了沉重的经济负担和心理压力。应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。所以，简单实用、准确灵敏的珠蛋白基因突变检测方法，是实现此病有效防控的前提与基础。
[0005]在目前的临床应用之中，常规使用的PCR
‑
反向点杂交技术(也称PCR
‑
RDB)采用定性PCR扩增结合反向点杂交法检测β地贫点突变。PCR
‑
RDB技术的优点是在一张杂交膜上可同时筛查多种点突变，区别于传统杂交法一次只能检测一种突变，目前国内外的β
‑
地中海基因突变的筛查试剂也大多使用该方法；缺点是过程复杂、耗时长、容易污染出现假阳性，并且灵敏度较低，容易出现漏检现象。
[0006]实时荧光PCR技术是近几年发展并大规模应用于临床的一种新技术，该技术在通过设计特异性的引物和探针组合、构建特异性的PCR反应来实现对靶标的定性或定量PCR检测。该技术避免了电泳的有毒、高污染风险操作，同时操作时间短、灵敏度高，但单管只能检测1个位点，无法单管检测多个位点，通量偏低。
[0007]与此同时，因为β地贫常规检测位点多达17个，且这17个位点区域存在部分位点间距离过近(小于常规Taqman探针设计长度)、个别位点存在连续3～5个GC碱基(易于形成发夹结构或与模板形成二级结构)等问题，导致探针设计难度大、探针特异性不佳等问题，从而导致设计出的临床应用产品特异性不佳、灵敏度不够等问题。
[0008]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的第一目的在于提供一种检测人类β
‑
地中海贫血基因分型的核酸组合，该核酸组合能够实现对β
‑
地中海贫血基因突变进行定性检测。
[0010]本专利技术的第二目的在于提供上述的检测人类β
‑
地中海贫血基因分型的核酸组合在制备检测人类β
‑
地中海贫血基因分型产品中的应用。
[0011]本专利技术的第三目的在于提供一种检测人类β
‑
地中海贫血基因分型的试剂盒，可以方便的应用到β
‑
地中海贫血基因突变的检测中。
[0012]本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0013]本专利技术提供了一种检测人类β
‑
地中海贫血基因分型的核酸组合，其包括用于检测β
‑
globin基因
‑
29、CD14/15、CD17、CD26、CD27/28和IVS1
‑
1位点的探针；
[0014]上述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示。
[0015]β
‑
globin基因的
‑
29、CD14/15、CD17、CD26、CD27/28、IVS1
‑
1是6个难于设计引物和探针的位点，其难度体现在：
[0016]β
‑
globin基因的CD14/15和CD17位点之间相邻6个脱氧核糖核苷酸、CD26和CD27/28位点之间相邻4个脱氧核糖核苷酸，常规设计中1条探针覆盖2个位点容易造成该条探针PCR扩增荧光信号非特异，较难调整。本专利技术人通过创造性劳动发现，探针设计过程中先保持待检测位点在探针的中间位置，然后适当的将探针往5
’
端或3
’
端移动1～4个核苷酸，能最大程度上避免因1条探针覆盖两个位点造成的非特异性扩增；该方法突破了常规的探针设计方式(常规探针设计一般会要求把SNP位点放在探针的接近中间位置)，该方法极端条件下可以让探针中的待检测位点位于探针5
’
或3
’
端附近。
[0017]常规探针设计过程中经常会碰到连续GC序列，对PCR反应有一定的影响，一般设计时会避开类似区域，实在无法避开时会考虑反向设计，或者对探针进行MGB、LNA修饰以缩短探针长度等方法规避连续GC序列。然而，在本专利技术中就存在待检测位点两侧均有4个以上的连续GC序列，且本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人类β
‑
地中海贫血基因分型的核酸组合，其特征在于，所述试剂盒中包括用于检测β
‑
globin基因
‑
29、CD14/15、CD17、CD26、CD27/28和IVS1
‑
1位点的探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37所示。2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合中还包括用于检测
‑
32、
‑
30、
‑
29、
‑
28、CD+40/43、Int、CD14/15、CD17、CD26、CD27/28、IVS1
‑
1、IVS1
‑
5、CD31、CD41/42、CD43、CD71/72和IVS
‑
II
‑
654相关位点的引物和探针；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.17所示，所述探针如SEQ ID NO.18
‑
SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.23
‑
SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.38
‑
SEQ ID NO.46所示。3.根据权利要求1或2所述的核酸组合，其特征在于，所述探针的5'端分别修饰不同的荧光基团，3'端分别修饰不同的淬灭基团；优选地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.18
‑
SEQ ID NO.46的探针的5
’
端的荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、ROX、NED、Texas red、CY3、CY5等荧光报告基团中的任意一种或几种；优选地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.18
‑
SEQ ID NO.46的探针的3
’
端修饰的荧光淬灭基团选自TAMARA、BHQ1、BHQ2、MGB等荧光淬灭基团中的任意一种或几种。4.如权利要求3所述的核酸组合在制备检测人类β
‑
地中海贫血基因分型产品中的应用。5.一种检测人类β
‑
地中海贫血基因分型的试剂盒，其特征在于，其包括检测β
‑
地中海贫血基因17个位点的8组检测物，所述8组检测物来源于权利要求1
‑
3任一项所述的核酸组合；所述8组检测物分别为：第一检测物：用于检测
‑
32、
‑
30、
‑
28位点，其包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；第二检测物：用于检测CD17、
‑
29位点，其包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24以及SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列；第三检测物：用于检测CD+40/43、Int位点，其包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27以及SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列；第四检测物：用于检测CD27/28、CD14/...

【专利技术属性】
技术研发人员：董瑞华，马霜，赵艳苹，汪再兴，
申请(专利权)人：武汉友芝友医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：