结核分枝杆菌的聚合酶链反应引物和探针制造技术

本发明专利技术涉及用于扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)不同基因片段的新型引物和松散分子信标和分子信标探针，用于鉴定M.tb DNA的存在和/或鉴定对抗结核药物的耐药性。本发明专利技术涉及检测M.tb和M.tb耐药性的引物、探针和相关用途。在一个方面，本发明专利技术提供了用于扩增选自rpoB基因、gyrA基因、gyrB基因、inhA启动子、rrs基因、eis启动子、embB基因、katG基因、dosR基因、IS6110基因、IS1081基因的结核分枝杆菌区域的一部分的分离的寡核苷酸组或引物组。组或引物组。组或引物组。

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌的聚合酶链反应引物和探针
[0001]本申请是申请日为2015年10月9日、申请号为2015800675122、专利技术名称为“结核分枝杆菌的聚合酶链反应引物和探针”的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2014年10月10日提交的美国临时专利申请号62/062,351的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
[0004]政府利益
[0005]本文所披露的专利技术至少部分在使用来自美国国立卫生研究院的资助号U01AI082174和R01AI080653提供的政府支持下完成。因此，美国政府在本专利技术中具有一定的权利。
专利

[0006]本专利技术涉及用于扩增和检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)中不同基因的片段的新型引物和松散分子信标(sloppy molecular beacon，SMB)和分子信标(molecular beacon，MB)探针，目的是鉴定M.tb DNA的存在和鉴定对抗结核药物的耐药性。
[0007]专利技术背景
[0008]结核病(TB)在近二十年前被宣布为全球公共紧急事件(WHO Global Tuberculosis Report 2013)。尽管全球结核病新发病例有所下降，但到2015年将不可能实现减少50％疾病的千年发展目标(WHO Global Tuberculosis Report 2013)。多药耐药(MDR)和广泛耐药(XDR)TB的发病率增加是对这些减少目标的严重威胁(WHO Global Tuberculosis Report 2013)。MDR TB定义为对用至少利福平和异烟肼的治疗有耐药性的TB，XDR TB定义为对用氟喹诺酮类抗生素和可注射药物阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素的治疗有耐药性的MDR TB。耐药TB患者最好尽可快得到鉴定，以便可以迅速启动适当的感染控制和治疗。Boehme,C.C.,et.al,2011,Lancet 377:1495
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1505。
[0009]由于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的生长非常缓慢，传统的表型方法可能需要数周至数月才能完全定义这种细菌的耐药性模式(Heifets,L.,et al.,J Clin Microbiol 38:1227
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1230；Kim,S.J.,2005,Eur Respir J 25:564
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569和PT,K.,and K.GP.,1985,Public health Mycobacteriology:Aguide for level III laboratory.Center for Disease Control,U.S Department of Health and Human Services,Atltanta,Georgia.)。分子测试给更快速的耐药检测带来了希望。Mtb并不天然含有耐药质粒；因此，分子测试针对染色体DNA。基因型测定相对容易设计，因为Mtb基因组具有非常高的序列保守程度。几乎所有药物敏感的临床Mtb分离物在耐药性靶中具有相同的DNA序列，除了少数易于鉴定的“天然多态性”之外。因此，耐药靶基因中与野生型序列的任何差异都表明存在对相应药物的耐药性。基因型测定比表型测定更快速和灵敏，因为DNA靶可以通过PCR扩增。可以通过早期杀死感染性生物体来减少生物危害。
[0010]现在已经明确确定了TB中大多数耐药性的遗传靶。实时PCR仍然是检测细菌突变
的最灵敏、快速和可靠的方法。几乎所有其他突变检测方法，包括PCR
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MS、微阵列、迷你阵列和下一代测序，都需要核酸扩增作为检测过程的第一步。相比之下，实时PCR可以使样品扩增、检测和分析全部在单个孔中进行。管不必打开，不需要复杂的流体。然而，还没有人能开发出一种广泛的耐药性测试方法，该方法足够简单和稳健从而可在参考实验室之外进行。因此，需要用于检测M.tb和M.tb对最常用的第一和第二线药物的耐药性的新型引物和探针。
[0011]专利技术概述
[0012]本专利技术涉及检测M.tb和M.tb耐药性的引物、探针和相关用途。
[0013]一方面，本专利技术提供了用于扩增选自rpoB基因、gyrA基因、gyrB基因、inhA启动子、rrs基因、eis启动子、embB基因、katG基因、dosR基因、IS6110基因、IS1081基因组成的组的结核分枝杆菌区域的一部分的分离的寡核苷酸组或引物组。所述组包括对该部分特异的一对正向和反向引物，其中每个引物具有与选自从下表1A和1B中列出的寡核苷酸序列基本上相同的序列。因此，每个引物具有与选自所述表中列出的寡核苷酸序列的互补序列基本互补的序列。在一些实施方案中，引物的序列与选自表1A和1B中列出的寡核苷酸序列相同。
[0014]第二方面，本专利技术提供了具有与选自从表2中列出的那些序列的一个基本上相同的序列的分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸包括选自表2所列的序列的序列。所述核酸可以在其两端分别用例如荧光团和猝灭剂进行标记，或者用与探针中的内部核苷酸连接的荧光团进行标记。荧光团的实例包括荧光素、花青5或德克萨斯红和TAMRA。猝灭剂的实例包括BHQ1、BHQ2和DABCYL。
[0015]本专利技术提供了含有一种或多种上述寡核苷酸组和核酸的试剂盒。所述试剂盒还可以包括DNA聚合酶、延伸核苷酸和缓冲液。
[0016]第三方面，本专利技术的特征在于用于检测结核分枝杆菌耐药性的方法。该方法包括以第一引物对扩增第一核酸靶序列以产生第一扩增子的步骤，其中(i)第一引物对对于选自由rpoB基因、gyrA基因、gyrB基因、inhA启动子、rrs基因、eis启动子、embB基因和katG基因组成的组的区域的一部分是特异性的，和(ii)每个引物具有与选自表1A和1B中列出的寡核苷酸序列基本上相同的序列，并检测第一扩增子中的突变。突变的存在指示了耐药性。在该方法中，检测步骤可以通过本领域已知的各种核酸检测技术进行，包括例如基于测序的技术和基于核酸或肽核酸探针杂交的技术。
[0017]在一个实施方案中，检测步骤通过以下方法进行，该方法包括：(i)在有利于形成探针
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靶杂交体的杂交条件下使第一扩增子与特异于突变的第一探针接触；(ii)进行熔解温度(Tm)分析以确定探针
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靶杂交体的测试Tm值；和(iii)将测试Tm值与预先确定的参考Tm值进行比较。如果与预先确定的Tm值不同，则测试Tm值表示存在突变。例如，测试Tm值具有远离参考Tm值的至少3(例如3、4或5)个标准偏差的偏移表示存在突变。相反，测试Tm值远离参考Tm值小于3个标准偏差的的偏移表示不存在突变。如本文所公开的，预先确定的参考Tm值可以是平均野生型Tm值。在一个实例中，如果测试Tm值低于预先确定的参考Tm值，例如至少3个标准偏差，则表示存在突变。否则，如果不低于预先确定的参考Tm值例如3个标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测样本中的多药耐药性结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的寡核苷酸组，所述寡核苷酸组包含：松散分子信标探针，其包含与选自SEQ ID NOs:54
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66的序列至少85％同一的探针序列；第一对正向和反向引物，其特异于选自katG基因、inhA启动子、rpoB基因、gyrA基因、gyrB基因、eis启动子、embB基因和rrs基因的第一区域的第一部分，其中每一个引物均具有与选自SEQ ID NOs:2
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5、7
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22、29
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45和49
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52的寡核苷酸序列至少85％同一的序列。2.权利要求1的寡核苷酸组，其中所述第一对引物选自SEQ ID NOs:2
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5、7
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22、29
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45和49
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52。3.权利要求1或2的寡核苷酸组，其中所述探针序列与选自SEQ ID NOs:54
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66的一个序列至少90％同一。4.权利要求3的寡核苷酸组，其中所述探针序列包含SEQ ID NOs:54
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66的一个序列。5.权利要求1
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4中任一项的寡核苷酸组，其中所述松散分子信标探针是标记的。6.权利要求5的寡核苷酸组，其中所述松散分子信标探针分别在其两端用荧光团和淬灭剂标记。7.权利要求6的寡核苷酸组，其中所述荧光团是荧光素、花青5、德克萨斯红或TAMRA。8.权利要求6的寡核苷酸组，其中所述淬灭剂是BHQ1、BHQ2或DABCYL。9.用于检测多药耐药性结核分枝杆菌的试剂盒，其包含权利要求1
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8中任一项所述的寡核苷酸组。10.权利要求9的试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：新泽西鲁特格斯州立大学，
类型：发明
国别省市：