用于TBEV等八种病原体联检的组合物及检测方法技术

本发明专利技术涉及微生物核酸的测定方法，特别地，本发明专利技术提供了一种用于联合检测八种病原体的引物和探针组合物和检测方法，这八种病原体包括莫氏立克次体、Q热立克次体、恙虫病东方体、埃立克体、斑点热群立克次体、无形体、荆门病毒和森林脑炎病毒，引物和探针组合物包括对应的8套引物和探针组合物，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
用于TBEV等八种病原体联检的组合物及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物制品
，尤其是一种联合检测这八种病原体的引物和探针组合物、液相芯片及其液相芯片非诊断性检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，我国蜱传疾病形势日益严峻，大多数是重要的自然疫源性疾病和人兽共患病，且蜱传疾病的病原体种类繁多，还可以同时携带多种病原体，包括病毒、细菌、立克次体及螺旋体等等。
[0003]立克次体是蜱传疾病主要病原体类型，立克次体是一类胞内寄生的原核细胞型微生物，在立克次体目(Rickettsiales)中包括立克次体(Rickettsiaceae)、无形体(Anaplasmataceae)和全孢菌(Holosporaceae)等科。对人类致病的立克次体主要有立克次体科中的立克次体属、东方体属、柯克斯体属、埃立克体属，以及无形体中的无形体属。立克次体病在全世界范围流行，我国流行的主要有地方性斑疹伤寒Q热、丛林斑疹伤寒(又名恙虫病)、埃立克次体病、斑点热、人粒细胞无形体病等，对应的病原体分别是莫氏立克次体(Rickettsiamooseri，MS)、Q热立克次体(简称Q热，Q fever Rickettsia，QF)、恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi，Ot)、埃立克次体(Ehrlichia，Eri)、斑点热群立克次体(Spotted fever group Rickettsia，Spotted fever group Rickettsia，SFGR)、嗜吞噬细胞无形体(简称无形体，Anaplasmaphagocytophilum，AP，曾称埃立克体Ehrlichia，Eh)等。
[0004]病毒也是蜱传疾病主要病原体的类型之一。近年来，随着蜱传疾病病毒谱的调查研究不断深入，新的潜在病毒谱也相继被发现并鉴定，如主要流行于中国中部的荆门病毒(Jingmen tick virus，JMTV)，该病毒在蜱叮咬人组织、牛、阳以及多种蜱中都有被检测到，但是目前针对荆门病毒的诊断及治疗还尚无可用检测试剂或产品；如2004年以来湖北、河南、江苏、浙江等地区高度散发出现的发热伴血小板减少综合征的主要病原体：发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Sever feverwith thrombocytopnia syndrome virus，SFTSV)，又称新布尼亚病毒，2011年SFTSV在我国被首次分离鉴定，病毒感染人体后引起的发热伴血小板减少综合征、发热、血小板和白细胞减少等主要临床表现，病情危重者可发生多脏器功能衰竭而死亡。SFTSV病毒感染病例都有明确的蜱虫叮咬历史，其发病死亡率达到12％
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30％；如主要流行于中国东北地区的森林脑炎病毒(Tick
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borne encephalitis virus，TBEV)(又称蜱传脑炎病毒)，可以导致了林区每年5
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7月份常见的以侵袭中枢神经统为主的自然疫源性急性传染病，多因劳动者在森林地区的劳动活动中被蜱叮咬而感染中枢神经系统导致的急性病毒性传染病。
[0005]据文献报道统计，1982年以来，我国新发蜱传病原体接近40种。蜱传疾病多具有较强的传染性和致病性，其中大部分都没有有效的疫苗，一旦救治不及时将会出现严重后果，给人类健康及畜牧业带来重大危害。上述立克次体致病后轻症患者主要表现为发热、多形皮疹、全身肌肉痛和头痛，重症患者表现为全身严重过敏反应、心肌炎、脑炎、肺栓塞、静脉血栓形成、出血、心力衰竭、呼吸衰竭、脓毒性休克等致命并发症。上述病毒致病后具有发
热、白细胞减少等相似的临床症状和流行特征，通过临床症状和血常规等实验室检测很难鉴别确定所感染的病毒种类。目前蜱传病原检测大多仅是针对单种致病原，或是多重病原体联合检测的方法灵敏度还不够高，不能够早期发现蜱传疾病的感染或流行，因此，急需一种快速、简便、准确、特异性强且可联合检测并分辨立克次体和病毒类型等病原体的产品和方法，以便及早发现、早诊断、以及尽早指导临床合理用药，或者满足对疑似蜱传疾病临床样品的大规模、高通量的流调检测需求。
[0006]液相芯片(Multi
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Analyte SuspensionArray，MASA)技术是整合了激光技术、流式细胞仪、数字信号处理和传统化学技术的一种新型生物分子检测技术，液相芯片技术支持单重和多重分析，可在多种测定方法中对蛋白质和核酸靶标进行高通量检测。液相芯片可广泛应用于各种免疫分析和核酸检测中，但是，目前国内液相芯片仍处于起步阶段，主要应用在科研领域，还未形成产业化。将液相芯片应用于多种病原体的联合检测，由于多重PCR是在一个反应体系内同时扩增多种病原，要保证每对引物不会与其他病原发生非特异性扩增，其中多重引物和探针的存在，杂交温度的选择也是一个技术开发时的瓶颈。因此，一方面要求各自的引物组合物配对必须高度特异。另一方面，在进行引物设计时还要尽量避免发卡结构和引物二聚体的产生，尤其要避免上游引物与任何一条下游引物超过连续4个碱基互补，否则会造成假阳性信号。最后，建立液相芯片检测体系不单单局限于构建良好的单个PCR反应，重点是如何筛选到最适合液相芯片的多重PCR的引物组合和反应条件。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种可一管联合检测八种蜱传病原体的液相芯片检测方法和产品。
[0008]为达到上述目的，本专利技术提供了一种引物和探针组合物，用于联合检测八种病原体，这八种病原体包括莫氏立克次体(MS)、Q热(QF)、恙虫病东方体(Ot)、埃立克次体(Eri)、斑点热群立克次体(SFGR)、无形体(Eh)、荆门病毒(JMTV)和森林脑炎病毒(TBEV)；这八种病原体对应的引物和探针组合物包括但不限于：与莫氏立克次体的GroEL基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组MS
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rF1、MS
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rF2、MS
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rR和探针r
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probe；与Q热立克次体的IS1111基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组QF
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F1、QF
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R1、QF
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A
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F、QF
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A
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R和探针QF
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probe；与恙虫病东方体的47KD的htrA基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组47KD
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F和47KD
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R和探针47KD
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probe；与埃立克体的GroEL基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组Eri
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F1、Eri
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R1、Eri
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F2、Eri
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R2和探针E
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probe；与斑点热群立克次体的190KD基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组SFGR
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F、SFGR
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R和探针Rr1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物和探针组合物，用于八种病原体的联合检测，所述八种病原体包括莫氏立克次体、Q热立克次体、恙虫病东方体、埃立克体、斑点热群立克次体、无形体、荆门病毒和森林脑炎病毒；所述引物和探针组合物包括但不限于：与莫氏立克次体的GroEL基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组MS
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rF1、MS
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rF2、MS
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rR和探针r
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probe；与Q热立克次体的IS1111基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组QF
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F1、QF
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R1、QF
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A
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F、QF
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A
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R和探针QF
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probe；与恙虫病东方体的47KD的htrA基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组47KD
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F和47KD
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R和探针47KD
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probe；与埃立克体的GroEL基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组Eri
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F1、Eri
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R1、Eri
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F2、Eri
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R2和探针E
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probe；与斑点热群立克次体的190KD基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组SFGR
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F、SFGR
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R和探针Rr190
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probe；与无形体的16S rRNA的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组Eh
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1、Eh
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2、Eh
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3、Eh
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4和探针H
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probe；与荆门病毒的S4片段的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组JMTV
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F1、JMTV
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R1、JMTV
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F2、JMTV
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R2和探针S4
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probe；与森林脑炎病毒的RdRp基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组TBEV
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F、TBEV
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R1、TBEV
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R2和探针T3
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probe；所述引物和探针具有序列如序列表SEQ ID NO:1
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34所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于：探针分别用磁珠标记后制备为检测微球，其中，所述探针r
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probe、所述探针QF
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probe、所述探针47KD
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probe、所述探针E
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probe、所述探针Rr190
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probe、所述探针H
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王波，尹飞飞，田秀颖，黄艺，贾毅博，王高玉，胡小媛，
申请(专利权)人：海南省人民医院，
类型：发明
国别省市：