用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物及其应用，其包括Blautia_obeum和Subdoligranulum中的一种或两种。本发明专利技术基于特异性序列设计了能够扩增这两段特异性序列的特异性引物及相应试剂盒；本发明专利技术采用从粪便中提取微生物菌群的基因组DNA进行扩增子测序的方法，提供了基于粪便样本的儿童过敏风险判断和检测方法，对儿童患者的过敏性疾病的风险进行准确预测。另外，可以通过qPCR的方法，利用特异性引物检测这两种标志菌株的含量，判断是否达到一定参考阈值来完成对儿童患者过敏风险的判断和预测；本发明专利技术操作简便，对儿童没有损害，节省成本，对过敏儿童判断的准确率达到100％。到100％。到100％。

【技术实现步骤摘要】
用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物分子标记物领域，具体涉及用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物及其应用。

技术介绍

[0002]过敏性疾病是一种自身免疫性疾病，在儿童中，过敏症状的发病率在20％左右。目前而言，过敏的诊断主要依靠侵入性的方法，包括皮肤点刺试验和血液免疫球蛋白E(IgE)检测。其中，皮肤点刺试验是将过敏原试剂点刺于挑破的表皮内，以观察反应情况，需要在医生的监视下进行，而且一旦出现过敏反应，处置不当会有生命危险。另一种IgE检测则需要采集儿童的血液方可进行，但只有IgE在体内达到一定浓度时才能被检测到，因此准确率大受影响。因此，以上两种对过敏的判断和检测方法对儿童的伤害性较大。
[0003]目前报道的关于无创方式判断过敏性疾病的方法是通过检测尿液中的相关蛋白的表达量进行判断，还有报道通过肠道中的菌群进行诊断食物过敏的方法，但是该方法是停留在小鼠实验阶段，并没有直接进行人群中进行验证，更没有针对儿童过敏进行验证，其准确度还是有待提高的，目前暂时还没有通过粪便样本中的特定菌群来直接判断儿童过敏性疾病的方法和手段，因此，亟需一种能够通过粪便样本中的特定菌群直接对儿童的过敏性疾病进行判断。

技术实现思路
：
[0004]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题时提供了一种用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述微生物标志物的特异性片段。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了基于所述特异性片段的特异性引物对。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述微生物标志物、所述特异性片段、所述特异性引物对在制备诊断儿童过敏性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
[0008]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了一种诊断儿童过敏性疾病的试剂盒。
[0009]本专利技术基于微生物标志物我们开发设计出两种细菌的特异性16S核糖体RNA基因片段，然后基于该特异性片段设计开发出每种菌的特异性引物对，经分子实验验证之后，发现该引物对有很好的敏感性和特异性。本专利技术还提供了通过粪便微生物检测的方法判断儿童过敏风险提供技术基础。
[0010]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物，其特征在于，其包括Blautia_obeum和Subdoligranulum中的一种或两种。
[0011]本
技术实现思路
还包括两个微生物标志物Blautia_obeum和Subdoligranulum的获得方法，包括以下步骤：
[0012]1)正常儿童粪便样本和过敏儿童粪便样本，提取其中的微生物基因组DNA；
[0013]2)PCR扩增16S核糖体rRNA序列的V3
‑
V4区，构建文库并上机进行测序；
[0014]3)对测序数据进行处理分析后，对过敏儿童和正常儿童组的细菌丰度进行差异分析，获得微生物标志物Blautia_obeum和Subdoligranulum。
[0015]本
技术实现思路
还包括用于鉴定所述的微生物标志物的特异性片段，所述Blautia_obeum的16S核糖体核酸区域的特异性片段如SEQ ID NO：1所示，所述Subdoligranulum的16S核糖体核酸区域的特异性片段如SEQ ID NO：2所示。
[0016]本
技术实现思路
还包括鉴定或扩增所述的特异性片段的引物对，鉴定或扩增Blautia_obeum的16S核糖体核酸区域的特异性片段的引物对包括如下序列：SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示；或SEQ ID NO：5所示和SEQ ID NO：6所示；或SEQ ID NO：7所示和SEQ ID NO：8所示。
[0017]本
技术实现思路
还包括鉴定或扩增所述的特异性片段的引物对，鉴定或扩增Subdoligranulum的16S核糖体核酸区域的特异性片段的引物对包括如下序列：SEQ ID NO：9所示和SEQ ID NO：10所示；或SEQ ID NO：11所示和SEQ ID NO：12所示；或SEQ ID NO：13所示和SEQ ID NO：14所示。
[0018]本专利技术还包括所述微生物标志物的特异性基因片段和特异性引物的获得方法，包括以下步骤：
[0019]1)在Silva(v138)数据库中，筛选Blautia_obeum和Subdoligranulum对应的序列；
[0020]2)在筛选出的序列中寻找各序列共有的基因片段(18～25bp)组成引物候选集；
[0021]3)在整个Silva参考数据库中，将每个候选引物去比对(完全匹配)，如果该引物比对上其他菌种，则将引物从候选中剔除；
[0022]4)最后将剩余的引物在16S核糖体RNA全长片段中定位，根据最前和最后的引物位置确定特异性片段基因和引物片段。
[0023]本
技术实现思路
还包括所述的微生物标志物、所述的特异性片段、所述的特异性引物对在制备诊断儿童过敏性疾病的试剂或试剂盒中的应用。
[0024]其中，所述试剂用于检测所述的标志物，所述试剂盒用于诊断儿童是否易患过敏性疾病。
[0025]其中，所述应用通过检测受试者样品中所述微生物标志物的细菌丰度是否达到一定阈值，当检测的细菌丰度低于阈值，则该受试者易患过敏性疾病，当检测的细菌丰度高于阈值，则该受试者不易患过敏性疾病；
[0026]作为任选地，当Blautia_obeum和Subdoligranulum都能被检测出来，且高于一定阈值，则该受试者不易于患过敏性疾病，当只能检测其中一种或均被能被检测出，但其中一个或两个菌低于阈值，则该受试者易于患过敏性疾病。
[0027]其中，所述细菌丰度是基于检测并分析靶向微生物标志物的16S核糖体核酸区域获得，作为任选地，所述微生物标志物Blautia_obeum和Subdoligranulum中的一种或两种。
[0028]其中，所述过敏性疾病包括过敏性鼻炎、食物过敏、特异性皮炎、哮喘或特应性喘息。
[0029]其中，所述受试者样品包括但不仅限于受试者的粪便，其他和肠道相关的样品也在本专利技术保护范围之内。
[0030]本
技术实现思路
还包括一种试剂盒，所述试剂盒包括检测所述的微生物标志物的试剂，作为任选地，所述试剂盒包括所述的特异性片段、所述的引物对。
[0031]其中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂，PCR扩增试剂，DNA marker或核酸染料中的一种或多种；所述核酸染料包括但不仅限于SYBR Safe DNA染料。
[0032]本
技术实现思路
还包括一种判断儿童过敏风险的微生物标志物方法，所述方法包括如下步骤：
[0033]1)提取未知是否过敏的儿童粪便微生物的基因组DNA；
[0034]2)利用16S测序或RT
‑
PCR方法确定Blautia_obeum和Subdoligranulum的相对含量；
[0035]3)根本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于诊断儿童过敏性疾病的微生物标志物，其特征在于，其包括Blautia_obeum和Subdoligranulum中的一种或两种。2.用于鉴定权利要求1所述的微生物标志物的特异性片段，其特征在于，所述Blautia_obeum的16S核糖体核酸区域的特异性片段如SEQ ID NO：1所示，所述Subdoligranulum的16S核糖体核酸区域的特异性片段如SEQ ID NO：2所示。3.鉴定或扩增权利要求2所述的特异性片段的引物对，其特征在于，鉴定或扩增Blautia_obeum的16S核糖体核酸区域的特异性片段的引物对包括如下序列：SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：4所示；或SEQ ID NO：5所示和SEQ ID NO：6所示；或SEQ ID NO：7所示和SEQ ID NO：8所示。4.鉴定或扩增权利要求2所述的特异性片段的引物对，其特征在于，鉴定或扩增Subdoligranulum的16S核糖体核酸区域的特异性片段的引物对包括如下序列SEQ ID NO：9所示和SEQ ID NO：10所示；或SEQ ID NO：11所示和SEQ ID NO：12所示；或SEQ ID NO：13所示和SEQ ID NO：14所示。5.权利要求1所述的微生物标志物、权利要求2所述的特异性片段、权利要求3或4所述的特异性引物对...

【专利技术属性】
技术研发人员：江伟，张姣，庾庆华，陈东波，沈阳，
申请(专利权)人：迪辅乐生物上海有限公司，
类型：发明
国别省市：