用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6；与野生型LAMA4基因的参考序列相比，所述LAMA4致病基因第2862至2869位缺失；或与野生型LAMA4基因的参考序列相比，所述LAMA4致病基因第2888位缺失。本发明专利技术还提供上述试剂在制备检测试剂盒中的应用。本发明专利技术提供的扩张型心肌病试剂盒能够将携带LAMA4致病基因c.2862_2869del或c.2888del杂合错义的患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断的生物标志物，明确变异致病性，提前干预恶性事件的发生；检测该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义。或者辅助临床判断具有重要意义。或者辅助临床判断具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，尤其涉及用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂及其应用。

技术介绍

[0002]扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一类以心脏左心室或双心室扩张、收缩功能不全为主要特征的心肌疾病。早期可仅表现为心脏扩大及收缩功能降低，后期往往出现慢性心力衰竭，是导致心力衰竭的重要原因之一。病程中常伴发心律失常、血栓栓塞，甚至SCD等并发症，预后不佳。DCM发病无明显地域差异，发病率随着年龄增加而升高，儿童发病者较罕见。患病率为(19～36.5)/10万不等。
[0003]DCM致病基因主要编码细胞结构及功能相关蛋白。前者绝大多数为肌节蛋白相关编码基因，也包括心肌细胞Z带、细胞核、细胞骨架及连接相关蛋白的编码基因；后者见于转录因子以及离子通道等细胞功能相关蛋白编码基因。遗传方式以常染色体显性遗传多见。LAMA4基因编码
‑
链亚型层粘连蛋白，是细胞外基质糖蛋白的一个家族，是基底膜的主要非胶原成分，参与多种生物过程，包括细胞粘附、分化、迁移、信号传导、神经突生长和转移。
[0004]基因检测对于患者临床诊断、危险分层、治疗及患者家属的早期预警非常重要，目前已发现扩张型心肌病LAMA4致病基因的许多突变位点，但是在前人的研究基础上，进一步发现新的LAMA4基因突变将有助于进一步研究扩张型心肌病，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床诊断具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对上述缺陷，提供用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂及其应用。
[0006]本专利技术目的在于提供：用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6；与野生型LAMA4基因的参考序列相比，所述LAMA4致病基因第2862至2869位缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；或与野生型LAMA4基因的参考序列相比，所述LAMA4致病基因第2888位缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
[0007]本专利技术经过大量试验、研究和分析成功地筛选出LAMA4致病基因新位点，并利用LAMA4致病基因新位点开发出能够用于快速、灵敏、有效的检测LAMA4致病基因新位点的检测试剂盒。LAMA4致病基因新位点具体信息见下表：
[0008][0009]本专利技术有益效果在于：本专利技术公开的LAMA4致病基因新位点可以作为临床辅助诊断扩张型心肌病的生物标志物，对扩张型心肌病的早期诊断，或者辅助临床判断具有重要意义；基于用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂及其应用开发的检测试剂盒，能够将携带LAMA c.2862_2869del或LAMA c.2888del杂合错义突变的患者和正常人群区分开，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。
附图说明
[0010]图1为实施例1中携带LAMA4 c.2862_2869del杂合错义突变患者的Sanger测序图；
[0011]图2为实施例1中携带LAMA4 c.2888del杂合错义突变患者的Sanger测序图；
[0012]图3为实施例2中携带LAMA4 c.2862_2869del先证者的家系图；
[0013]图4为实施例2中携带LAMA4 c.2888del先证者的家系图。
具体实施方式
[0014]下面通过具体实施方式进一步详细说明，但并不因此而限制本专利技术。
[0015]下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0016]试剂来源：PCR预混液：2
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Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg
2+
、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNase
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Free H2O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886
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01C。
[0017]实施例1：验证实验
[0018](1)LAMA4 c.2862_2869del验证实验
[0019]在临床诊断为扩张型心肌病患者(女，43岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下，采集2
‑
4mL人类全血EDTA抗凝样本，
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80℃保存，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
[0020]S1、提取基因组DNA：对患者的全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。
[0021]S2、准备PCR反应体系：该PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase
‑
Free H2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：
[0022]正向引物(LAMA4
‑
E21F，SEQ ID NO:5)：5'AAAGTCATTTCTAAATCACGA 3'；反向引物
(LAMA4
‑
E21R，SEQ ID NO:6)：5'CCCCAAGTCATTATAGGTT 3'。长度：478bp。
[0023]S3、将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。73℃终延伸90s。
[0024]S4、取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。
[0025]S5、PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测扩张型心肌病LAMA4致病基因新位点的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6；与野生型LAMA4基因的参考序列相比，所述LAMA4致病基因第2862至2869位缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；或与野生型LAMA4基因的参考序列相比，所述LAMA4致病基因第2888位缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘哲，梁庆渊，赵娜娜，赖开生，刘昕超，高璇，李方玉，曲晓欢，黄靖雯，侯青，惠汝太，
申请(专利权)人：百世诺北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：