鱖鱼传染性脾肾坏死病荧光定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，包括:荧光定量PCR引物的设计与合成、重组质粒的构建、qPCR反应条件的建立及优化、绘制标准曲线进行样品检测。普通PCR检测存在无法对病原进行定性和定量检测的技术问题，探针法荧光定量PCR检测则存在使用探针昂贵的技术缺陷，鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法弥补了国内该项目的空白。该项目的空白。

【技术实现步骤摘要】
鱖鱼传染性脾肾坏死病荧光定量检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，具体是一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法。

技术介绍

[0002]鳜鱼是我国淡水养殖品种。传染性脾肾坏死病毒是鳜鱼重大疫病病原，该病毒引发的鳜鱼传染性脾肾坏死病病毒流行快、发病率高，并且目前尚无有效控制措施，严重影响鳜鱼养殖业的发展。近年来，养殖鳜鱼发生大面积的暴发性流行病，导致鳜鱼大量死亡，造成严重的损失。由于水生动物病毒类疾病目前尚无特效治疗药物，因此推行鳜鱼的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。目前通用的检测方法是电子显微镜法：进行病鱼脾、肾组织石蜡切片，H&E染色，显微镜观测被感染细胞肿大3～4倍；进行病鱼脾、肾组织超薄切片，投射电镜下观测到病毒颗粒该方法简便易行，但敏感性较低，特异性弱，容易误判，其次对于鳜鱼病毒的检测方法还有生物指示法、生化检测法、免疫学方法、免疫电镜技术、细胞培养方法、分子生物学方法。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长，费用高，因此对于广大养殖户的快速准确的检测方法，难以推广，限制了这些技术的应用和发展。
[0003] 传染性脾肾坏死病病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)是虹彩病毒肿大细胞病毒属的代表种，测序结果显示，ISKNV全长为111,362bp，包含124个潜在的ORF，编码长度为40到1,208个氨基酸。电镜下观察可知其结构与上述虹彩病毒科肿大细胞病毒属相符，且成熟病毒粒子由3部分组成，分别是直径为105 nm的球形病毒核心、厚26 nm的电子非致密区和厚约20 nm的病毒囊膜
[1] 。据不完全统计，1994年以来广东省鳜鱼该病发病率达30％，导致近2亿元的年经济损失
[2]。鳜病毒病暴发流行与季节有关，病毒粒子在鱼的养殖水体中可通过水平和垂直两种途径进行传播。该病毒致病性强，在25
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34 ℃范围内通过人工浸泡感染和注射感染等方法，7
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12天内受感染鳜鱼在便全部死亡
[3]，感染鳜鱼的脾脏、腮、肾脏、肝脏等组织器官，感染时会发出现细胞肿大。在粤、湘、鄂、苏、浙等鳜鱼的主要养殖区，作为主要的鳜病毒病流行，感染率高，且全年均会发病，致死率超90%
[4
‑
6]。另外，发病案例在韩国、朝鲜等亚洲国家也有出现，该病对该鱼养殖业的发展存在严重制约，此前我国将其列为二类疫病，国际兽医局(International Epizootic Office, OIE)将其列为申报疫病。
[0004]目前对于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的前沿PCR检测方法有普通PCR检测和探针法荧光定量PCR检测两种。普通PCR检测存在无法对病原进行定性和定量检测的技术问题，探针法荧光定量PCR检测则存在使用探针昂贵的技术缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案： 一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，包括荧光定量PCR引物的设计与合成、重组质粒的构建、qPCR反应条件的建立及优化、绘制标准曲线进行样品检测。
[0007]作为本专利技术的进一步技术方案：所述荧光定量PCR引物的设计与合成包含根据 ISKNV 的 MCP 基因序列（序列号：AF370008），对 ISKNV 的实时荧光定量 PCR 的上、下游引物进行设计及筛选。
[0008]作为本专利技术的进一步技术方案：所诉实时荧光定量 PCR 引物包含上游引物和下游引物，上游引物序列为5
’
ATGCCAATCATCTTGTTGTAGCC3
’
，下游引物序列为5
’
GGTGTCATTTAACGACCTGGTG3
’
。
[0009]作为本专利技术的进一步技术方案：所述重组质粒的构建以ISKNV的MCP基因DNA作模板，用PCR法扩增获得的目的片段，进行2 %琼脂糖凝胶电泳检测，将目的片段通过A
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T连接法插入到pMD 18
‑
T载体上构建重组质粒。
[0010]作为本专利技术的进一步技术方案：所述PCR法扩增获得的目的片段预扩增长度为142bp。
[0011]作为本专利技术的进一步技术方案：所述qPCR反应条件的建立及优化以引物浓度的优化实验按单一变量原则进行，选取0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 μM为终浓度对上、下游引物的浓度进行优化。按照嵌合荧光法 qPCR优化后反应程序同时进行qPCR，选取反应结果最优的引物浓度。
[0012]作为本专利技术的进一步技术方案：所述标准曲线的绘制将提得的质粒溶液用微量分光光度计平行测定其浓度三次取平均值，即可得到质粒溶液准确的质量浓度，根据公式换算成拷贝数。
[0013]一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，包含以下步骤：A、将内脏组织（≤10 mg脾脏组织或≤25 mg肝脏、肾脏组织）放入1.5 ml的EP管中，使用研磨棒于冰上将其研磨捣碎。加入180 μl的Buffer ATL。
[0014]B、再加入20 μl的 proteinase K，涡旋震荡5
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10 s。在56 ℃温浴至组织完全消化，可间断地拿出震荡。进入步骤B前震荡15 s。
[0015]C、加入200 μl的Buffer AL，涡旋振荡直至管内液体呈均匀悬液。56 ℃水浴10 min。
[0016]D、加入200 μl浓度为96 %
‑
100 %的乙醇。涡旋振荡至混匀。
[0017]E、转移步骤3中的混合液全部到2 ml的圆底收集管上的DNeasy Mini spin滤柱中，以8000 rpm转速离心1 min。此步骤完成后弃滤液。
[0018]F、将DNeasy Mini旋转滤柱放在2 ml圆底收集管上，加500 μl Buffer AW 1，以8000 rpm转速离心1 min。此步骤完成后弃滤液。
[0019]G、将DNeasy Mini 旋转滤柱放在2ml圆底收集管上，加500 μl Buffer AW 2，以14000 rpm转速离心3 min。此步骤完成后弃滤液。
[0020]H、把DNeasy Mini spin滤柱放在一个新的1.5 EP管或2 ml 离心管中。
[0021]I、吸取200 μl的Buffer AE/无菌水加至旋转滤柱的吸附膜上，室温（15 ℃
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25 ℃）放置1 min之后，以8000 rpm转速离心1 min。
[0022]J、为增大DNA产量，重复步骤I。
[0023] 以ISKNV的MCP基因DNA作模板，用普通PCR法扩增获得预扩增长度为1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，其特征在于，包括荧光定量PCR引物的设计与合成、重组质粒的构建、qPCR反应条件的建立及优化、绘制标准曲线进行样品检测。2.根据权利要求1所诉的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，其特征在于，所诉上荧光定量PCR引物的设计与合成包含引物一对、优化后的PCR扩增反应体系。3.根据权利要求2所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物上游引 简称ORF006L ，引物序列为5
’
ATGCCAATCATCTTGTTGTAGCC3
’
，下游引物简称ORF006R，引物序列为5
’
GGTGTCATTTAACGACCTGGTG3
’
。4.根据权利要求2所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，其特征在于，所述引物的扩增片段长度为142bp。5.根据权利要求2所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，其特征在于，所述优化后的PCR扩增反应体系包含20 μl反应体系、50 μl反应体系。6.根据权利要求5所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病TB Green荧光定量检测方法，其特征在于，所述优化后的20 μl PCR扩增反应体系包含物质3μl10
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【专利技术属性】
技术研发人员：李雪雁，刘琪，梁慧仪，林嘉威，叶树才，黄晓声，贾晓菲，
申请(专利权)人：电子科技大学中山学院，
类型：发明
国别省市：