外泌体miRNA作为顺铂耳毒性生物标志物及其靶向治疗中的应用制造技术

本发明专利技术公开外泌体miRNA作为顺铂耳毒性生物标志物及其靶向治疗中的应用，属于生物技术领域，本发明专利技术利用体外构建小鼠顺铂耳毒性模型进行研究，在无菌环境下解剖产后3天的新生小鼠耳蜗基底膜，在皿孔皿中进行培养过夜，在实验组中加入50uM顺铂进行培养48小时，而对照组中加入等量的磷酸缓冲液进行同样的培养，收集的培养上清利用梯度离心的方法分离外泌体。解析了小鼠顺铂耳毒性模型下组织分泌外泌体中的mi RNA谱，并发现了实验组外泌体即顺铂耳毒性下分泌外泌体中携带10特异性mi RNA，其可作为特异性的生物标志物用于小鼠顺铂耳毒性的诊断，从新的方面就解析了小鼠在顺铂耳毒性模型下的特异性分子信息。型下的特异性分子信息。型下的特异性分子信息。

【技术实现步骤摘要】
外泌体miRNA作为顺铂耳毒性生物标志物及其靶向治疗中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及外泌体miRNA作为顺铂耳毒性生物标志物及其靶向治疗中的应用。

技术介绍

[0002]据2021年3月世界卫生组织(WHO)报告，全球约有4.66亿人患有致残性听力损失，约占世界人口的5％，并且估计到2050年将有9亿多人出现残疾性听力障碍。其中感音神经性听力损失患者占据主要部分，已经成为一个严重的全球性社会公共健康问题。生活中许多因素会导致感音神经性听力损失，其中包括化疗药物顺铂的使用带来的耳毒性副作用。目前，有关顺铂耳毒性发生机制方面的研究还不是很清晰，特别是内耳感觉细胞在顺铂药物作用后发生的信号转导方式。这意味着对顺铂耳毒性机制的研究及相关的治疗靶向药物的开发缺失一些有价值的信息。因此，需要更加全面的探究内耳感觉细胞在遭受顺铂药物损伤后发生了那些信号转导。
[0003]外泌体是一种由几乎所有细胞分泌的脂双层纳米囊泡，它可以携带多种生物分子(包括蛋白质、脂质、核酸分子等)参与细胞间的信号转导，从而介导重要的分子信号交流过程。研究表明，外泌体miRNA是外泌体中最丰富的一类核酸分子，在多种疾病的发生发展过程中发挥着重要的调控作用，其通常具有组织特异性，因此在许多疾病中被用作生物标志物用于疾病的诊断(例如血浆外泌体miRNA在子宫内膜癌筛查中的应用，专利号CN112575088B)。但是，目前在内耳感音神经性听力损失中缺乏外泌体miRNA相关的研究。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供外泌体miRNA作为顺铂耳毒性生物标志物及其靶向治疗中的应用。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种用于检测顺铂耳毒性的试剂盒，包括用于检测miRNA表达量的试剂，所述miRNA为以SEQ ID NO：1～10中的至少一种。
[0007]用于检测SEQ ID NO：1～10任一所述的检测miRNA表达量的试剂在制备用于检测顺铂耳毒性的试剂盒中的应用。
[0008]用于检测SEQ ID NO：1～10任一所述的检测miRNA表达量的试剂在筛选治疗顺铂耳毒性的潜在药物的应用。
[0009]一种用于治疗听力损失修复的药物，所述药物包括以下组SEQ ID NO：11～18中的至少一种miRNA分子。
[0010]进一步的，所述miRNA分子作为顺铂耳毒性调控靶点。
[0011]进一步的，所述药物还包括用于搭载miRNA分子的外泌体。
[0012]SEQ ID NO：11～18任一所述的miRNA在制备治疗顺铂耳毒性的药物中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014]1、本专利技术首次解析了小鼠顺铂耳毒性模型下组织分泌外泌体中的miRNA谱，并发现了实验组外泌体即顺铂耳毒性下分泌外泌体中携带10特异性miRNA，其可作为特异性的生物标志物用于小鼠顺铂耳毒性的诊断，从新的方面就解析了小鼠在顺铂耳毒性模型下的特异性分子信息。
[0015]2、本研究发现实验组外泌体中包含8个与细胞凋亡、氧化应激及炎症反应调控明显相关的miRNA分子可作为顺铂耳毒性新的调控靶点，用于顺铂耳毒性听力损失修复治疗。这些分子由组织分泌外泌体携带可以参与细胞间信号交流，从而可以介导顺铂耳毒性诱导下的内耳感觉细胞损伤。在新的视角解析了顺铂耳毒性的分子调控机制。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1是小鼠顺铂耳毒性体外模型构建过程；
[0018]图2是外泌体smallRNA测序分析。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]本专利技术利用体外构建小鼠顺铂耳毒性模型进行研究，具体的构建过程如图1所述
[0021](1)首先，在无菌环境下解剖产后3天(P3)的新生小鼠耳蜗基底膜，利用celltak将组织贴合到圆形盖玻片上，并放入3.5cm的皿孔皿中进行培养。培养基使用DMEM/F12，加入10％的胎牛血清和0.05％的氨苄抗生素。在37℃，5％CO2浓度的培养环境中培养过夜，让耳蜗组织能够贴合玻片生长。然后更换培养基并将培养基中的胎牛血清更换为为外泌体胎牛血清(170000g，4℃下，超速离心大于12小时后取2/3上清用作去除外泌体的胎牛血清)，在实验组(cisplatingroup)中加入50uM顺铂进行培养48小时，而对照组(Controlgroup)中加入等量的磷酸缓冲液(PBS)进行同样的培养。其中每24小时更换一次配液，并收集各组组织培养上清置于50mlEP管中，用于提取组织分泌外泌体。
[0022](2)下面将收集的培养上清利用梯度离心的方法分离外泌体。将实验组和对照组中的培养上清首先在600g，4℃环境下离心10分钟，将上清转移到新的50mlEP管中，再在2000g，4℃环境下离心20分钟后，去除沉淀中的细胞碎片，转移分离上清至新的50mlEP管中。随后，经过0.22um的细菌过滤器过滤上清，再经4℃，16500g的高速离心收集上清液去除沉淀中的大囊泡。最后将上清转移至Beckman高速离心管中进行110000g的超速离心，4℃下离心2小时后倒掉离心上清液，用磷酸缓冲液重悬后再次进行110000g的超速离心2小时以纯化分离的外泌体。离心结束后，倒掉上清液，用200ul的磷酸缓冲液将外泌体沉淀重悬，并收集到1.5ml的低粘附EP管中，放入
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80℃冰箱中冻存并用于后续的miRNA测序分析。
[0023](3)实验组和对照组外泌体各含3个生物学重复，利用smallRNA测序平台进行外泌体小RNA测序分析。首先提取外泌体样本总RNA，将总RNA使用PAGE电泳分离并切胶纯化分离大小为18
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30nt的RNA。然后将纯化的小RNA的5
’
端用5
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adenylated和3
’
端3
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blocked的单链DNA接头连接。将带有UMI的RT引物加入体系与3
’
接头杂交。随后以带有UMI的RT引物进行逆转录延伸合成一链cDNA。接着使用高敏聚合酶对一链cDNA进行扩增。再使用PAGE胶分离110
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130bp大小的PCR产物作为测序文库，并进行定量及pooling环化。然后对文库进行质检，质检合格后再上机测序。
[0024]得到测序结果后，将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测顺铂耳毒性的试剂盒，其特征在于，包括用于检测miRNA表达量的试剂，其特征在于，所述miRNA为SEQ ID NO：1～10中的至少一种。2.用于检测SEQ ID NO：1～10任一所述的检测miRNA表达量的试剂在制备用于检测顺铂耳毒性的试剂盒中的应用。3.用于检测SEQ ID NO：1～10任一所述的检测miRNA表达量的试剂在筛选治疗顺铂耳毒性的潜在药物的应用。4.一种用于治疗听力损失修复...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴人杰，艾静如，张莎莎，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：