用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法，所述绝对荧光定量PCR引物对包括正向引物La129和反向引物La428，所述正向引物La129的序列如SEQIDNO：1所示，所述反向引物La428的序列如SEQIDNO：2所示。本发明专利技术还建立了一种嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR检测方法，该方法包括利用所述的引物对进行荧光定量PCR检测。与传统方法相比，荧光定量PCR具有快速、敏感、特异且稳定的优点。其灵敏度比普通PCR高1000倍，能准确、灵敏地检测样品中嗜酸乳杆菌的含量。灵敏地检测样品中嗜酸乳杆菌的含量。灵敏地检测样品中嗜酸乳杆菌的含量。

【技术实现步骤摘要】
用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)属于乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)，是乳酸菌的一种，为革兰氏阳性菌，主要存在于小肠中。嗜酸乳杆菌作为肠道益生菌在维持肠道菌群平衡以及拮抗致病菌方面具有良好的作用，其主要通过分泌代谢产物(产生乳酸)、竞争排斥、免疫调节等多种方式来发挥益生作用。嗜酸乳杆菌作为重要的益生菌，已经被广泛应用于发酵乳制品、益生菌产品、医药、饲料等的生产中，但是其检测方法相对复杂且不能进行定量分析，因此需要一种更灵敏高效的方法检测产品中嗜酸乳杆菌的含量。
[0003]目前，国内外主要通过普通PCR对目的基因进行扩增及测序分析以达到对样品中菌种进行分析的目的，其操作简便，设备要求较低，反应迅速，已成为现代菌种检测的主要方法，但该方法灵敏度低，无法对样品中的嗜酸乳杆菌进行定量。
[0004]鉴于此，建立一种准确、可靠、可定量的嗜酸乳杆菌检测方法对产品中嗜酸乳杆菌检测数量的规范具有重要意义。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法。
[0006]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对，所述绝对荧光定量PCR引物对包括正向引物La129和反向引物La428，所述正向引物La129的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物La428的序列如SEQ ID NO：2所示。
[0007]本专利技术还提供了一种检测嗜酸乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的绝对荧光定量PCR引物对。
[0008]其中，所述试剂盒还包括阳性质粒La
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T/DH5α，所述质粒序列如SEQ ID NO：3所示。
[0009]本专利技术还提供了所述的特异性引物对、所述的检测试剂盒在检测嗜酸乳杆菌中的应用。
[0010]本专利技术还提供了一种嗜酸乳杆菌的定量检测方法，所述定量检测方法采用的是绝对荧光定量PCR方法。
[0011]其中，所述绝对荧光定量PCR方法具体包括以下步骤：
[0012]1)以嗜酸乳杆菌的DNA作为扩增模板，使用所述引物对进行扩增得到扩增产物；
[0013]2)利用步骤1)扩增所得的扩增产物，构建重组质粒La
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T/DH5α，所述质粒序列如SEQ ID NO：3所示；
[0014]3)以构建的La
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T/DH5α重组质粒作为阳性标准品，进行荧光定量PCR反应，制备标准曲线；
[0015]4)提取待测样品基因组DNA作为模板，与步骤2)的阳性标准品一同进行荧光定量PCR反应，将得到的Ct值代入步骤3)所得标准曲线，从而计算出待测样品中嗜酸乳杆菌的基因拷贝数。
[0016]其中，步骤1)中，PCR扩增反应体系包括：2
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TaqMix12.5μL、ddH2O9.5μL、引物对正反向各1μL、DNA模板1μL；反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸10min。
[0017]其中，步骤4)中，所述荧光定量PCR的反应体系包括：DNA模板2μL，所述引物对正反向各0.4μL，2
×
SYBRGreenMasterMix10μL，BSA0.2μL，ddH2O7μL；反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，反应程序共40个循环；熔解曲线程序：95℃，1min；51℃，30s；95℃，30s。
[0018]其中，所述待测样品为粪便样品、发酵乳制品、土壤样品、发酵食品、饮料或益生菌产品中的一种或几种。
[0019]综上，本专利技术建立了一种能够检测样品中嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR方法。首先，根据NCBI中嗜酸乳杆菌全基因组序列设计特异性引物，随后将扩增片段与pMD19
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T载体连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，构建阳性重组质粒La
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T/DH5a。最后，建立标准曲线并对其灵敏性、特异性进行验证。结果表明，建立的嗜酸乳杆菌绝对荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性好，可用于样品中嗜酸乳杆菌的测定。
[0020]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具备以下优点：
[0021]1、本专利技术所述的方法，用普通PCR扩增时，可检测DNA的最低浓度为100pg/μL。用荧光定量PCR扩增时，可检测DNA的最低浓度为100fg/μL，比普通PCR检测的灵敏度高1000倍。
[0022]2、应用普通PCR方法不能对样品中嗜酸乳杆菌进行定量，而荧光定量PCR可对样品中嗜酸乳杆菌进行定量，并且不需要凝胶电泳观察结果，节省时间。
[0023]3、本专利技术建立的绝对荧光定量PCR方法可获得样品中嗜酸乳杆菌的绝对数量，便于不同样品之间的比较。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例中特异性引物对的普通PCR筛选结果；
[0025]图2为本专利技术实施例中特异性引物对的荧光定量PCR筛选结果；
[0026]图3是本专利技术实施例中特异性引物灵敏度验证的PCR检测结果；
[0027]图4是本专利技术实施例中目标样本以不同比例混入冗余DNA的染料法实时荧光定量PCR扩增曲线与溶解曲线；
[0028]图5为La
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T/DH5α重组质粒的标准曲线图；
[0029]图6为待测样品溶解曲线；
[0030]图7为普通PCR的灵敏性检测图；
[0031]图8为荧光定量PCR的灵敏性检测图。
具体实施方式
[0032]下面通过具体实施例对本专利技术所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出，以下实施例只用于对
技术实现思路
的描述，并不构成对本专利技术保护范围的限制。
[0033]本专利技术所用菌株及试剂材料来源：嗜酸乳杆菌为本实验室从健康人体粪便自行分离获得；重组质粒La
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T/DH5a委托江苏金唯智生物科技有限公司构建；细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRaMiniBESTBacteriaGenomicDNAExtractionKitVer.3.0购自TaKaRa公司。实施例1嗜酸乳杆菌特异性引物对的筛选
[0034]1、引物的设计与合成
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测嗜酸乳杆菌的绝对荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR引物对包括正向引物La129和反向引物La428，所述正向引物La129的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物La428的序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种检测嗜酸乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的绝对荧光定量PCR引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质粒La
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T/DH5α，所述质粒的序列如SEQ ID NO：3所示。4.权利要求1所述的引物对、权利要求2或3所述的检测试剂盒在检测嗜酸乳杆菌中的应用。5.一种嗜酸乳杆菌的定量检测方法，其特征在，所述定量检测方法采用的是绝对荧光定量PCR方法。6.根据权利要求5所的嗜酸乳杆菌的定量检测方法，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR方法具体包括以下步骤：1)以嗜酸乳杆菌的DNA作为扩增模板，使用权利要求1所述引物对进行PCR扩增得到扩增产物；2)利用步骤1)扩增所得的扩增产物，构建重组质粒La
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T/DH5α；3)以构建的La
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T/DH5α重组质粒作为阳性标准品，进...

【专利技术属性】
技术研发人员：张姣，侯艳敏，蒋秋悦，陈东波，沈阳，庾庆华，
申请(专利权)人：迪辅乐生物上海有限公司，
类型：发明
国别省市：