一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针。所述引物根据如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的靶位点设计得到；crRNA探针根据如SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示的靶向位点设计得到。一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其由冻干试剂1，包括所述的引物、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA报告序列；缓冲液1；冻干试剂2，包括所述的Cas12蛋白；缓冲液2；基因组DNA提取试剂1、2；紫光手电组成。利用基因组DNA提取试剂处理菌液；通过引物、重组酶聚合酶和dNTP，扩增靶位点基因；借助Cas12蛋白，在crRNA探针指导下，结合猪链球菌靶位点双链DNA底物，激活非特异性切割单链DNA报告序列的特点而设计的一种高灵敏度、高特异性的快速、可视化检测猪链球菌的方法。测猪链球菌的方法。测猪链球菌的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针。

技术介绍

[0002]猪链球菌(Streptococcus suis)是一种重要的人畜共患病病原菌，猪链球菌病是国家规定的二类动物疫病。猪链球菌不仅能引起猪的淋巴结肿大，脑膜炎和败血症等，还能引起人感染的感染，脑膜炎和中毒性休克。猪感染猪链球菌的主要血清型是1型、2型、7型、9 型、14型等。2型猪链球菌的流行性最广，致病性最强。猪链球菌在上世纪六十年代被发现，随后猪链球菌病开始在养猪行业中流行起来，引起世界范围的重视。仔猪抵抗力弱的猪易感。当气温变化、饲养密度大、卫生条件差等因素的养殖场会导致该病的暴发。猪呼吸道和扁桃体上广泛存在猪链球菌。猪链球菌和其他致病菌经常发生混合感染或继发性感染。猪链球菌的致病性主要和毒力因子有关，毒力因子主要有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外因子、谷氨酸脱氢酶、粘附素等。
[0003]近些年，猪链球菌病的暴发越来越多。猪链球菌病是我国养殖业最重要的传染病之一，该致病菌还能感染人，对人类生命安全也造成了严重威胁。猪链球菌成为规模化养殖场的机会性致病菌，对猪链球菌的提前检测对于疾病的诊断与治疗相当重要。因此建立完善、准确的检测体系尤为重要。
[0004]目前我国国家卫生健康委员会在其编写的《人感染猪链球菌病诊断方案》中，推荐使用一般实验室检查和病原学鉴定的方法对可疑猪链球菌感染进行实验室诊断。猪链球菌的常规检测方法主要有形态学、血清学、免疫学和普通PCR。但这些检测方法繁琐而且对设备要求高，不利于基层推广和检测。近年来，等温扩增技术如环介导等温扩增技术(Loop
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mediated Isothermal Amplification，LAMP)，重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)等因其不需要昂贵的设备、反应快速，灵敏度高等优点发展迅速，逐渐在临床上应用起来。RPA是一种恒温扩增技术。反应温度在37℃
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42℃之间，不需要温度升降进行变性，RPA不需要依赖昂贵仪器，灵敏度、特异性都较好，RPA可以实现对病原菌便携式的快速检测。
[0005]CRISPR系统是细菌及古细菌利用Cas效应蛋白并在crRNA探针的引导下抵御外源核酸入侵的一种获得性免疫防御系统。其能够切割和消除病毒入侵和其他外源核酸的威胁。CRISPR
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Cas系统利用自身的RNA来和目标DNA进行序列配对，从而识别特异性序列。S. pyogenes Cas9(SpCas9，一般简称Cas9)，因为其具有简单的PAM序列和在细胞内较高的基因编辑效率，因而是应用最广泛的Cas蛋白。 Cas12a(又称为Cpf1)是和Cas9不同的CRISPR系统。
[0006]Cas12a蛋白识别富含T的PAM位点，在靶序列的5'端形成5个核苷酸的粘性末端，同时其自身可加工形成成熟的crRNA。Cas12a具有即可切割双链DNA也可切割单链DNA的切割
活性。它在切割序列特异性的目标双链DNA之后，它的单链DNA的酶活性被激活，变成一种单链DNA切碎机，将切割它附近的任何单链DNA。它对单链DNA 切割速度极快，达到大于1000个分子每秒，且可以持续数小时以上。因此，Cas12a识别一个特异性双链DNA序列，可以切割数以百万计的非特异性的单链DNA分子。利用此特性，可将发光分子通过单链DNA 与一种阻止这种发光分子发光的抑制分子连接在一起(简称为报告序列)。当Cas12a被序列特异性的双链DNA激活后，它会切割将这种发光分子和这种抑制分子连接在一起的单链DNA，这就移除了发光抑制分子，让发光分子发光，从而检测到光信号。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种基于CRISPR的检测猪链球菌的方法、试剂盒、引物对及探针，该方法通过设计RPA特异性引物，利用RPA扩增技术对核酸进行放大，将产物在crRNA探针的引导下，利用Cas12a酶切单链DNA报告序列，通过荧光信号进行猪链球菌检测，不仅能快速检测得到结果，并且解决了当前检测方法不敏感、时间长、成本高等缺点。
[0008]本专利技术选择猪链球菌的谷氨酸脱氢酶基因gdh为检测靶基因。基于猪源链球菌NCTC 10234(ATCC 43765)的gdh基因参考序列，结合实验室已测序的23株猪链球菌的gdh基因序列和国家生物技术信息中心NCBI基因库中检索到的62株猪链球菌的靶标基因gdh并进行比对，选择gdh基因的保守区域设计RPA引物和crRNA探针。
[0009]优选地，所述RPA引物的序列为(F1) CATGTACGGTCAATACAAACGCCTCC，(R1) TATCAGTGAAGTAAACCAAACCGTAACCAG或(F2)TTTGATGCAGGTGTCTTGACTGGTAAACCTC，(R2) ACAGTTTGGTCTTTGAAGGATTTACCGTT或与其序列相似性大于 75％的序列。
[0010]优选地，所述RPA引物的序列如SEQ ID NO:5至6或SEQ ID NO:7至8所示。
[0011]在gdh基因的保守区域寻找PAM位点5'
‑
TTTN
‑
3'， CRISPR/Cas12a系统的靶向特异性由crRNA探针3'末端的20个核苷酸序列决定的，所需的靶序列必须紧接在5'
‑
TTTN的PAM位点之后，并从中确定crRNA序列。
[0012]优选地，所述crRNA探针的指导序列为 AUGCAGGUGUCUUGACUGGU或 GUUUACUUCACUGAUAACAU；所述crRNA探针的非指导序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU或与其序列相似性大于75％的序列。
[0013]优选地，所述crRNA探针的序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10所示。
[0014]优选地，所述crRNA探针是可引导Cas12a剪切猪链球菌靶基因和单链DNA报告序列的RNA形式。
[0015]本专利技术实现目的所采用的方案是：一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其由冻干试剂1，包括所述的引物、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA报告序列；缓冲液1；冻干试剂2，包括所述的Cas12蛋白；缓冲液2；基因组DNA提取试剂1、2；紫光手电组成。
[0016]优选地，所述单链DNA报告序列为含有T和A或仅含有T的富集序列。
[0017]优选地，所述单链DNA报告序列含有TTT、ATT、TAT、TTA、 AAT、ATA、TAA、AAA中的至少一种。
[0018]优选地，所述单链DNA报告序列的5'端用Atto 425、BODIPYFL、FAM、Oregon Green 488、TET、JOE、R6G、Yakima Yellow本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR的检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：包括引物、重组酶聚合酶、dNTP、crRNA探针、单链DNA报告序列、缓冲液、Cas蛋白及基因组DNA提取试剂。2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列为含有T和A或仅含有T的富集序列。3.如权利要求2所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列含有TTT、ATT、TAT、TTA、AAT、ATA、TAA、AAA中的一种。4.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA报告序列的5'端用Atto 425、BODIPY FL、FAM、Oregon Green 488、TET、JOE、R6G、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、AquaPhluor 593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670和Cy5.5中的一种进行修饰；且所述单链DNA报告序列的3'端用BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB和Dabcyl修饰。5.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述Cas蛋白为Cas12、Cas13或Cas14；所述Cas12为Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12g、Cas12h或Cas12i；所述试纸盒包括冻干试剂1、缓冲液1、冻干试剂2、缓冲液2、基因组DNA提取试剂1和2、紫光手电。6.如权利要求1所述的一种基于CRISPR方式检测猪链球菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测反应体系为：5
‑
20μM上、下游引物，1
×
浓度的重组酶聚合酶，1
×
浓度的dNTP，10
‑
100nM的crRNA探针，1
‑
10μM的FAM
‑
TTATT
‑
Dabcy...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜向党，李成龙，商艳红，孙佳蕊，崔静宇，杜姊娴，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：