一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的方法、试剂及应用技术

本申请公开了一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的方法、试剂及应用。本申请方法包括获取待测柑橘溃疡病菌七个基因序列，对七个基因序列进行多位点序列分型分析，确定等位基因并编号，将七个基因的等位基因编号串联，作为序列型，将其与参考菌株序列型比较，获得待测菌株溯源信息；参考菌株为已知溯源信息的柑橘溃疡病菌；七个基因为XAC_RS07980、XAC_RS21550、copB、egl、fliL、hrpA和pliY。本申请采用七个适用于柑橘溃疡病菌多位点序列分型的持家基因进行溯源检测，能高分辨率区分不同地理来源菌株，对菌株区域研究、进化、传播、病害流行、防治都具有重要意义，本申请方法能用于柑橘溃疡病菌的鉴定和溯源。菌的鉴定和溯源。菌的鉴定和溯源。

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的方法、试剂及应用


[0001]本申请涉及柑橘溃疡病菌检测领域，特别是涉及一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的方法、试剂及应用。

技术介绍

[0002]柑橘是重要的热带和亚热带水果，广泛分布于世界140多个国家和地区，是产量最大的世界第一大水果。柑橘溃疡病是全世界柑橘生产危害最大的病害之一，是国内外植物检疫的重要检测对象。
[0003]柑橘溃疡病的病原菌即柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)。柑橘溃疡病菌有多个菌系和亚种，根据地理分布和致病性的差异，将柑橘溃疡病菌分为5个菌系，即A、B、C、D、E菌系。其中，A菌系起源于亚洲，是侵袭力最强、危害柑桔品种最多、危害范围最广的菌系。研究显示，A菌系本身也存在变异，例如A*菌系和A
W
菌系，两个变异菌系分别起源于不同的地区。并且，现有的菌系分化研究显示，不同地区的致病菌，例如A菌系，存在普遍的分化现象。
[0004]目前，虽然已经有显微镜诊断、血清学诊断、PCR诊断、DNA探针诊断等多种方法对不同菌系的柑橘溃疡病菌进行检测和诊断；但是，对柑橘溃疡病菌的溯源检测和研究还相对缺乏。

技术实现思路

[0005]本申请的目的是提供一种新的柑橘溃疡病菌溯源鉴定或溯源检测的方法、试剂及应用。
[0006]本申请采用了以下技术方案：
[0007]本申请的一方面公开了一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的方法，其包括获取待测柑橘溃疡病菌菌株七个基因的序列，对七个基因的序列进行多位点序列分型分析，确定各基因的等位基因并编号，将七个基因的等位基因编号按顺序串联，作为待测柑橘溃疡病菌菌株的序列型，将待测柑橘溃疡病菌菌株的序列型与参考菌株的序列型进行比较，获得待测柑橘溃疡病菌菌株的鉴定或溯源信息；其中，参考菌株为已知溯源信息的柑橘溃疡病菌菌株，参考菌株的序列型为参考菌株的七个基因的等位基因编号按待测柑橘溃疡病菌菌株相同的顺序串联获得的序列型；七个基因为XAC_RS07980、XAC_RS21550、copB、egl、fliL、hrpA和pliY。本申请中，溯源信息包括但不仅限于柑橘溃疡病菌菌株的菌系和起源；本申请通过将待测柑橘溃疡病菌菌株的序列型与参考菌株的序列型进行比较获得待测柑橘溃疡病菌菌株的鉴定或溯源信息，例如，将与待测柑橘溃疡病菌菌株的序列型最近的参考菌株的鉴定或溯源信息赋予待测柑橘溃疡病菌菌株。
[0008]本申请采用XAC_RS07980、XAC_RS21550、copB、egl、fliL、hrpA和pliY七个基因对柑橘溃疡病菌进行多位点序列分型(MLST)分析，具有较高的分辨率，能够对柑橘溃疡病菌进行鉴定，对其地理来源进行溯源，对柑橘溃疡病菌的区域多样性研究，以及了解和掌握柑
橘溃疡病菌的进化、传播和病害发生流行具有重要意义。采用本申请的方法对柑橘溃疡病菌进行鉴定和溯源分析，能够有效提高柑橘溃疡病的防治效果。
[0009]本申请的一种实现方式中，序列型由七个基因的等位基因编号按XAC_RS07980
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XAC_RS21550
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copB
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egl
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fliL
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hrpA
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pliY的顺序串联获得。
[0010]本申请的一种实现方式中，本申请的柑橘溃疡病菌溯源检测方法还包括种群结构分析，本申请的种群结构分析包括，将包含2个及以上序列型的分型组看作是1个克隆复合体；聚类时，在1个克隆复合体中定义了一个祖先序列型，将祖先序列型作为其它序列型进化的基础；各序列型与祖先序列型之间通过直线相连，直线的长短表示同源关系的远近；以此获得待测柑橘溃疡病菌菌株与参考菌株的种群结构。
[0011]本申请的一种实现方式中，种群结构分析时，序列型之间只存在1个等位基因编号差异的称作单位点变异，存在2个等位基因编号差异的称作双位点变异，不划分在任何1个克隆复合体内的序列型定义为单体。
[0012]本申请的一种实现方式中，本申请的柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测方法还包括将七个基因的序列按XAC_RS07980
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XAC_RS21550
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copB
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egl
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fliL
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hrpA
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pliY的顺序拼接，获得分析序列，采用待测柑橘溃疡病菌菌株与参考菌株的分析序列构建系统发育树。
[0013]本申请的一种实现方式中，系统发育树的构建方法为最大似然法和/或邻接法。
[0014]本申请的一种实现方式中，本申请的柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测方法还包括对待测柑橘溃疡病菌菌株和参考菌株进行全基因组SNP位点聚类分析。
[0015]本申请的一种实现方式中，全基因组SNP位点聚类分析包括，将待测柑橘溃疡病菌菌株和参考菌株的SNP位点分别按照相同的顺序串联起来，作为各菌株的分析序列，基于各菌株全基因组SNP位点的分析序列构建系统发育树。
[0016]需要说明的是，本申请的柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测方法经过多位点序列分型分析即可获得待测柑橘溃疡病菌的鉴定或溯源信息，种群结构分析、七个基因串联获得的分析序列的系统发育树、全基因组SNP位点聚类分析等，都只是进一步从不同角度验证多位点序列分型分析和溯源检测的准确性。本申请的实施例中，对供试菌株的MLST分析结果，与群结构分析、七个基因串联获得的分析序列的系统发育树、全基因组SNP位点聚类分析等的结果基本一致；说明本申请基于七个基因MLST分析的鉴定或溯源检测方法，能够有效的区分不同地理来源的柑橘溃疡病菌菌株。
[0017]还需要说明的是，本申请的全基因组SNP位点聚类分析实际上也能够单独进行柑橘溃疡病菌溯源检测或鉴定；并且，从理论上来说，基于全基因组SNP位点的鉴定和溯源更精准，这对解决技术性国际贸易争端、克服技术性贸易壁垒具有重要意义。本申请率先将全基因组SNP位点用于柑橘溃疡病菌鉴定和溯源，具有创新性。从操作简便性或者成本来说，本申请基于七个基因的柑橘溃疡病菌鉴定和溯源更具有优势，能够满足日常的常规检验检疫使用需求，也能够满足柑橘溃疡病菌溯源或区域性分析的基础研究使用需求。
[0018]本申请的另一方面公开了一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的试剂，包括扩增柑橘溃疡病菌七个基因的引物组合，本申请的七个基因具体为XAC_RS07980、XAC_RS21550、copB、egl、fliL、hrpA和pliY。
[0019]本申请的一种实现方式中，引物组合包括扩增XAC_RS07980基因的第一引物组，扩增XAC_RS21550基因的第二引物组，扩增copB基因的第三引物组，扩增egl基因的第四引物
组，扩增fliL基因的第五引物组，扩增hrpA基因的第六引物组，扩增pliY基因的第七引物组；第一引物组的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列；第二引物组的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的方法，其特征在于：包括获取待测柑橘溃疡病菌菌株七个基因的序列，对七个基因的序列进行多位点序列分型分析，确定各基因的等位基因并编号，将七个基因的等位基因编号按顺序串联，作为待测柑橘溃疡病菌菌株的序列型，将待测柑橘溃疡病菌菌株的序列型与参考菌株的序列型进行比较，获得待测柑橘溃疡病菌菌株的鉴定或溯源信息；所述参考菌株为已知溯源信息的柑橘溃疡病菌菌株，参考菌株的序列型为参考菌株的七个基因的等位基因编号按待测柑橘溃疡病菌菌株相同的顺序串联获得的序列型；所述七个基因为XAC_RS07980、XAC_RS21550、copB、egl、fliL、hrpA和pliY。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述序列型由七个基因的等位基因编号按XAC_RS07980
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XAC_RS21550
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copB
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egl
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fliL
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hrpA
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pliY的顺序串联获得。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括种群结构分析，所述种群结构分析包括，将包含2个及以上序列型的分型组看作是1个克隆复合体；聚类时，在1个克隆复合体中定义了一个祖先序列型，将祖先序列型作为其它序列型进化的基础；各序列型与祖先序列型之间通过直线相连，直线的长短表示同源关系的远近；以此获得待测柑橘溃疡病菌菌株与参考菌株的种群结构；优选的，序列型之间只存在1个等位基因编号差异的称作单位点变异，存在2个等位基因编号差异的称作双位点变异，不划分在任何1个克隆复合体内的序列型定义为单体。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括将七个基因的序列按XAC_RS07980
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XAC_RS21550
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copB
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egl
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fliL
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hrpA
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pliY的顺序拼接，获得分析序列，采用待测柑橘溃疡病菌菌株与参考菌株的分析序列构建系统发育树；优选的，所述系统发育树的构建方法为最大似然法和/或邻接法。5.根据权利要求1
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4任一项所述的方法，其特征在于：还包括对待测柑橘溃疡病菌菌株和参考菌株进行全基因组SNP位点聚类分析；优选的，所述全基因组SNP位点聚类分析包括，将待测柑橘溃疡病菌菌株和参考菌株的SNP位点分别按照相同的顺序串联起来，作为各菌株的分析序列，基于各菌株全基因组SNP位点的分析序列构建系统发育树。6.一种柑橘溃疡病菌鉴定或溯源检测的试剂，其特征在于：包括扩增柑橘溃疡病菌七个基因的引物组合，所述七个基因为XAC_RS07980、XAC_RS21550、copB、egl、fliL、hrpA和pliY。7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于：所述引物组合包括扩增XAC_RS07980基因的第一引物组，扩增XAC_RS21550基因的第二引物组，扩增copB基因的第三引物组，扩增egl基因的第四引物组，扩增fliL基因的第五引物组，扩增hrpA基因的第六引物组，扩增pliY基因的第七引物组；所述第一引物组的上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列；所述第二引物组的上下游引物分别为Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列；所述第三引物组的上下游引物分别为Seq ID No.5和Seq ID No.6所示序列；所述第四引物组的上下游引物分别为Seq ID No.7和Seq ID No.8所示序列；...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓丽，高瑞芳，章桂明，张丹丹，李娜，王颖，
申请(专利权)人：深圳海关动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：