一种实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法技术

本发明专利技术公开了一种实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法，属于生物技术领域。该方法以五日热巴尔通体gltA为靶标基因设计得到如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的引物和如SEQ ID NO:3所示的荧光探针。本发明专利技术建立的实时荧光RPA检测五日热巴尔通体方法只特异性检测五日热巴尔通体，无种间无交叉反应，具备高特异性和高灵敏度的特点，为医疗卫生机构及实验室特别是乡村、野外等卫生条件相对恶劣地区五日热巴尔通体菌感染的快速诊断提供重要技术支撑。巴尔通体菌感染的快速诊断提供重要技术支撑。巴尔通体菌感染的快速诊断提供重要技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法。

技术介绍

[0002]五日热巴尔通体(Bartonella quintana,Bqu)引起的战壕热首次爆发于第一次世界大战的战壕中，波及百万余人，危害极大。现今，在我国云南、福建、广西、海南、河南、四川、安徽等地均出现过病例，不同年龄组均有发病，以偏远贫困人群易感多发。它是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌，其感染症状主要表现为以5天为间隔的周期性发热，伴随着红细胞菌血症，可持续数周、数月不等，同时也可能出现内心膜炎、脑膜炎等，免疫缺陷性病人一般会进一步发展为杆菌样血管瘤(Bacillary angiomatosis，BA)和杆菌样紫癜(Bacillary peliosis，BP)。人体虱是传播五日热巴尔通体的主要媒介，在人与动物隔离的情况下，在猫、狗及其跳蚤中也检测出了五日热巴尔通体，揭示五日热巴尔通体是一种潜在的人畜共患病原体。因此，在狗、猫中监测五日热巴尔通体对宠物源性感染防控具有重要意义。
[0003]目前，巴尔通体感染诊断检测方法主要借助血清学技术，其中间接免疫荧光是唯一的商品化试剂盒，但是血清学检测技术实验操作繁琐、耗时长，不利于在感染现场进行实时监测，且并不能准确反应感染发生的状态(正在发生或一过性感染)。实验室检测巴尔通体通常使用聚合酶链PCR技术和细菌分离培养，巴尔通体的营养需求苛刻，生长周期长，且感染宿主的菌血症水平一般比较低，组织、血液样本培养常常无法分离到细菌，并不适宜作为巴尔通体感染的实时、准确的检测手段。PCR在检测血液及组织中的巴尔通体运用较为成熟，然而PCR检测需要精确的温控循环和较长的反应时间，且结果解读只能在实验室内完成，无法满足现场快速诊断的需求。
[0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)，是一种等温基因扩增技术，能够在人体温度条件下高效扩增痕量DNA模板的组合酶制剂，利用改造的DNA工具酶与引物结合形成蛋白
‑
DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列并启动DNA合成，对模板上的目标基因进行指数式扩增。由于其具有灵敏度高、扩增时间短等优点，已被用于检测多种病原体感染，因此建立实时荧光RPA方法检测五日热巴尔通体具有很好的临场应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法，以五日热巴尔通体gltA基因为靶标基因设计得到特异性引物与荧光探针(exo
‑
RPA)，利用荧光探针技术建立五日热巴尔通体的实时荧光RPA检测方法。
[0006]为建立有效的检测五日热巴尔通体的实时荧光RPA方法，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术首先提供一种用于检测五日热巴尔通体的实时荧光RPA方法的特异性引
物，所述引物包括：
[0008]正向引物：GTGGAGCGAATGAAGCGTGCCTAAAGATGT(SEQ ID NO:1)；
[0009]反向引物：TCGGTGACCAAAACCCATAAGACGGAAAGG(SEQ ID NO:2)。
[0010]本专利技术还提供与前述引物配合使用的探针，所述探针为：
[0011]P:AATAGGCTCTGTCGAAAGAATTCCTGAG[FAMdT]T[THF]A[BHQdT]TGCACGAGCAAAA
‑
C3Spacer(SEQ ID NO:3)。
[0012]本专利技术还提供含有前述引物及探针的试剂盒，所述试剂盒还包括DNA模版、乙酸镁、溶解剂、干粉酶制剂反应管(其中包括重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶)。
[0013]本专利技术提供的实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法包括以下步骤：
[0014](1)提取样本中的DNA；
[0015](2)以步骤(1)中的DNA为模版，以所述引物和所述探针进行实时荧光RPA反应；
[0016](3)分析反应结果；
[0017]其中，所述实时荧光RPA反应的体系(反应总体系50μL)如下：
[0018]模版DNA2μL正向引物(10μM)2.1μL反向引物(10μM)2.1μL探针(10μM)0.6μL乙酸镁2μL溶解剂20μLddH2O21.2μL
[0019]进一步地，所述实时荧光RPA反应的条件为37℃孵育20min。
[0020]本专利技术还提供上述实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法在五日热巴尔通体菌感染快速诊断中的应用。
[0021]作为优选，所述五日热巴尔通体的最低检测DNA极限浓度为101copies。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0023]1、本专利技术选取五日热巴尔通体一段保守的特异性基因gltA设计特异性引物和荧光探针，建立能够高效、快速检测五日热巴尔通体的方法，其最低检测DNA极限浓度为101copies，可以实现特异性检测五日热巴尔通体，与巴尔通体其他菌种均无交叉扩增性，特异性好。
[0024]2、本专利技术建立的实时荧光RPA方法具备高特异性和高灵敏度的特点，能够实现五日热巴尔通体感染的快速检测，为医疗卫生机构及实验室特别是乡村、野外等卫生条件相对恶劣地区五日热巴尔通体菌感染的快速诊断提供重要技术支撑。
附图说明
[0025]图1为实施例中五日热巴尔通体RPA检测方法的特异性分析，其中：A为本专利技术提供的引物的普通PCR的特异性检测；B为实时荧光RPA检测的特异性扩增曲线，1
‑
7分别为五日热巴尔通体(Bartonella quintana)，格拉汉姆巴尔通体(Bartonella grahamii)，Bartonella washoensis，文森巴尔通体(Bartonella vinsonii)，Bartonella tribocorum，汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)和阴性对照；C为不同巴尔通体扩增序
列比对分析。
[0026]图2为实施例中实时荧光RPA检测方法的敏感性分析，其中：A为实时荧光RPA敏感性检测的扩增曲线；B为CT值与模板拷贝数相关性分析；C为实时荧光RPA概率回归分析；注：扩增曲线1
‑
6分别对应105‑
100拷贝/μL；扩增曲线7为阴性对照。
具体实施方式
[0027]以下实施例仅用于说明和解释本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0028]实施例1
[0029]本实施例提供一种实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的方法，具体如下：
[0030]1.材料与方法
[0031]1.1菌株和质粒
[0032]菌株包括五日热巴尔通体(Bartonella quintana，JK31)，格拉汉姆巴尔通体(Bartonella graham本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的特异性引物，所述引物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。2.用于实时荧光RPA检测五日热巴尔通体的探针，其序列如SEQ ID NO:3所示。3.一种实时荧光RPA检测试剂盒，包括权利要求1所述特异性引物和权利要求2所述探针。4.根据权利要求3所述的实时荧光RPA检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA模版、乙酸镁、溶解剂和干粉酶制剂反应管，其中所述干粉酶制剂反应管包括重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。5.权利要求1所述特异性引物、权利要求2所述探针或者权利要求3或4所述实时荧光RPA检测试剂盒在实时荧光RPA检测五日热巴尔通体中的应用。6.一种实时荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁聪俐，王春艳，张浩然，胡婧卓，王蒙，蔡雨豪，周梦琴，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：