用于病原微生物耐药基因检测的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了用于病原微生物耐药基因检测的引物组、试剂盒及方法，所述引物组包括序列如SEQ ID NO.2n

【技术实现步骤摘要】
用于病原微生物耐药基因检测的引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于病原微生物检测
，具体涉及一种用于病原微生物耐药基因检测的引物组、试剂盒，以及利用该引物组、试剂盒通过靶向测序技术检测病原微生物耐药基因的方法。

技术介绍

[0002]抗生素的发现和应用使细菌性感染导致的人类疾病和死亡大幅度下降，它是现代医学发展的里程碑；但是由于抗生素滥用，致病菌耐药现象越来越严重，某些菌株甚至出现了多重耐药及泛耐药性，且有上升趋势并不断扩散，给临床治疗带来了极大的挑战。
[0003]耐药菌的耐药机制包括β
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内酰胺酶的产生、外膜孔蛋白oprD:的缺失、主动外排系统的过度表达等，几种耐药机制单独或共同作用引起耐药菌的耐药性。耐药菌的耐药机制之一是其可产生超广谱β
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内酰胺酶(ESBLs)、金属β
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内酰胺酶(MBLs)、苯唑西林酶(OXA)和AmpC酶等多种失活酶或钝化酶。ESBLs可灭活几乎所有青霉素类抗生素、单环β
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内酰胺类抗生素和绝大多数头孢菌素，但其活性可被克拉维酸和他唑巴坦等β
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内酰胺酶抑制剂抑制；MBLs可水解碳青霉烯类抗生素和除单环β
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内酰胺类抗生素以外的β
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内酰胺类抗生素，且其活性不被β内酰胺酶抑制剂抑制；OXA是另一种β内酰胺酶，可水解绝大多数广谱头孢菌素，且其活性不被克拉维酸抑制；AmpC酶又称头孢菌素酶，可导致细菌对头孢菌素、替卡西林和哌拉西林耐药。部分耐药菌由于先天性缺乏或基因突变导致菌体细胞膜缺乏外膜蛋白OprF、OprD、OprB等多种抗菌药物进入菌体的膜通道蛋白，使相应抗菌药物在菌体内无法达到有效抗菌浓度，如OprD突变可导致碳青霉烯类抗生素耐药。主动外排机制是由各种外排蛋白系统介导的把抗菌药物等有害物质从细菌细胞内泵出的主动排出过程，外排系统具有能量依赖性、底物广泛性、系统多样性及功能复杂性的特点。
[0004]传统的耐药菌耐药检测依赖于体外药物敏感试验，多使用固体培养基或者液体培养基做体外培养，而且耐药菌的耐药性一般依据MIC即最低抑菌浓度。由于细菌的生长繁殖需要一定时间，故上述方法的检测周期较长，不能同时处理批量样本。随着技术发展，耐药菌诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室。由于耐药菌的核酸序列即基因片段都是特异的，有别于其他非耐药菌，故检测其特有的基因片段序列可用来鉴别耐药菌，目前基因检测技术已成为临床检验科和基础实验室对耐药菌检测的重要检测技术。对于病原微生物耐药基因的检测，目前通用方法是采用二代测序平台进行宏基因组的测序，该平台存在测序时间长、测序读长短，测序结果存在大量人源基因组DNA污染、测序数据量高且测序结果较难解读的问题。纳米孔靶向测序(Nanopore Targeted Sequencing)方法是一种代表性的基因检测技术，能够快速、客观地检测出临床样本中的疑似致病微生物(包括细菌、真菌和病毒)。其主要特点是读长更长，平均读长可达20kb，最长可达到Mb级别；结合高效的基因组核酸提取和建库方式，测序结果经过生物信息学处理分析后与专业医学微生物数据库进行比对分析，可以获得样本中所有微生物的种属信息以及所携带的耐药和毒力基因信息。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供用于纳米孔靶向测序检测病原微生物耐药基因的引物组、试剂盒以及检测方法，实现病原微生物耐药基因的快速即时检测。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术提供的用于病原微生物耐药基因检测的引物组包括序列如SEQ ID NO.2n
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1所示的F端引物，以及与F端引物对应的R端引物序列如SEQ ID NO.2n所示，且n的数值为1～17。
[0008]本专利技术通过对检测靶标涉及特异性引物，并在引物5
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端加上了通用序列，可以实现同时对多达20中不同类型耐药基因的检测。
[0009]本专利技术提供的引物组能够特异性的提高测序数据中病原微生物的比例，故采用该引物组进行病原微生物检测时，不需要额外进行人源基因组DNA去除的操作。
[0010]本专利技术进一步提供了包含上述引物组的检测试剂盒，该检测试剂盒中含有带标签引物，其中带标签引物的F端标签引物序列如SEQ ID NO.2n
‑
1所示，其对应的R端标签引物序列如SEQ ID NO.2n所示，且n的数值为18～113。
[0011]进一步地，在上述技术方案中，标签引物的5
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端进行了磷酸化修饰。
[0012]可以理解的是，在上述检测试剂盒中，还可以包含DNA提取试剂、PCR扩增试剂等。
[0013]本专利技术还提供了上述引物组或检测试剂盒在基于纳米孔靶向测序检测病原微生物耐药基因中的应用，其中应用方法包含如下步骤：
[0014]S1、提取病原微生物感染样本的核酸；
[0015]S2、采用本专利技术提供的引物组进行多重PCR扩增；
[0016]S3、以步骤S2所得扩增产物为模板，加入标签引物进行第二轮扩增；
[0017]S4、将第二轮扩增产物纯化后连接测序接头；
[0018]S5、采用Nanopore测序平台对步骤S4所得连接产物进行测序，并对测序产生的数据进行分析。
[0019]在上述技术方案中，由于本专利技术提供的引物组可以特异性提高测序数据中病原微生物耐药基因的比例，故在提取核酸时无需进行人源基因组DNA的去除，特别适配于血液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸腹水、口腔拭子、脓液等人源基因组含量高的样本类型。
[0020]在上述技术方案中，对步骤S1所得核酸的质量要求较低，使用常规的磁珠法等自动化仪器提取的核酸即可以满足后续建库测序的要求，在提取核酸总量在50pg以上，即可极显著的提升微量样本的建库成功率。
[0021]进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中多重PCR扩增的反应体系包括：50pg～100ng的核酸6μL，2X扩增酶混合液10μL，100nM的引物组4μL；所述多重PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性15s，60℃退火延伸2min，10个循环；4℃暂存。
[0022]基于本专利技术提供的引物组，并配合优化后多重扩增反应条件，所得扩增产物在不进行人源基因组DNA去除的情况下，测序数据中微生物的占比就可以达到95％以上，可见本专利技术提供的引物有效解决了病原微生物耐药基因检测中人源基因组DNA污染的难题。
[0023]进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中第二轮PCR扩增的反应体系为：扩增产物20μL，2X扩增酶混合液15μL，10μM带标签引物2μL，无菌超纯水补至50μL；所述第二轮PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min；94℃变性15s，62℃退火延伸15s，72℃延伸30s，30个循
环；72℃终延伸2mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于病原微生物耐药基因检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括序列如SEQ ID NO.2n
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1所示的F端引物，以及与F端引物对应的R端引物序列如SEQ ID NO.2n所示，且n为1～17。2.包含权利要求1所述引物组的检测试剂盒。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有带标签引物，所述带标签引物的F端标签引物序列如SEQ ID NO.2n
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1所示，其对应的R端标签引物序列如SEQ ID NO.2n所示，且n为18～113。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述带标签引物的5
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端进行了磷酸化修饰。5.如权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的检测试剂盒在基于纳米孔靶向测序检测病原微生物耐药基因中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下过程：S1、提取病原微生物感染样本的核酸；S2、采用权利要求1所述的引物组进行多重PCR扩增；S3、以步骤S2所得扩增产物为模板，加入标签引物进行第二轮扩增；S4、将第二轮扩增产物纯化后连接测序接头；S5、采用Nanopore测序平台对步骤S4所得...

【专利技术属性】
技术研发人员：张骥诚，王颖，席再军，廖瑞，方涛，龙志成，
申请(专利权)人：武汉明德生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：