脐带血血浆制品、组织和细胞外泌体的分离方法，其组合物及使用方法技术

本文描述了用于分级和分离血小板、血小板和细胞外囊泡衍生的生长因子、外泌体、球蛋白、纤维蛋白原和白蛋白的新方法，以及使用分离的血小板、血小板和细胞外囊泡衍生的生长因子、外泌体、球蛋白、纤维蛋白原和白蛋白在受试者中再生组织、治疗受试者的纤维蛋白原血症或凝血缺陷、治疗缺血和缺氧、治疗受试者中的干眼综合征、骨科疾病或牙科疾病的方法。本文还描述了用于培养哺乳动物(例如人)细胞的生长培养基。养基。养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脐带血血浆制品、组织和细胞外泌体的分离方法，其组合物及使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年11月29日提交的美国临时专利申请号62/942,063的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
专利

[0003]本专利技术整体上涉及从脐带血、外周血以及其他生物液体和组织中分离血小板、外泌体、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、外泌体的方法，及其组合物和使用方法，包括用于培养哺乳动物细胞和治疗疾病和病症的药剂和方法。
[0004]专利技术背景
[0005]脐带血(UCB)是出生后留在胎盘中的婴儿血液。UCB在胎盘中产生，是除胎盘外最丰富的干细胞来源，比包括骨髓在内的任何成人组织都丰富。UCB血浆是UCB、胎盘和胎儿的细胞外液体，含有蛋白、脂质因子和携带胎盘、子宫、母体和婴儿之间的信号的外泌体。约5％的UCB采集自全世界每年超过3000万的新生儿。大多数UCB存有包括干细胞在内的单核细胞。
[0006]UCB血浆含有血小板、生长因子(VEGF、G
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CSF、EGF和FGF)、促炎细胞因子(IL
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2、IL
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6、IFN
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γ、TNF
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α)和其他促进人细胞存活和生长的因子(Ehrhart,et al.,2018)。EV是细胞释放到细胞外环境中的细胞质囊泡。血小板是没有细胞核的小细胞(2
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3μm)。由称为巨核细胞的细胞产生的血小板含有被包装成颗粒的生长因子和细胞因子。当被激活时，血小板会释放这些细胞因子和生长因子。人血小板长期以来一直用在培养人细胞的生长培养基中，以及用在治疗骨科和牙科问题和干眼综合征中。
[0007]细胞培养基需要生长因子和细胞因子来支持和刺激细胞生长和分化。传统上，细胞在获自妊娠奶牛的胎牛的胎牛血清(FBS)中生长。在FBS中生长的人细胞会摄取牛血清蛋白，而牛血清蛋白在细胞被移植到人体中时会引发免疫应答。由于广泛食用牛奶，许多人都具有对牛蛋白的抗体。在FBS中生长的细胞可能表达在被移植时激活免疫排斥的牛血清蛋白。出于这个原因，美国食品和药物管理局(FDA)要求使用“无异源(xeno
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free)”培养基来培养用于移植到人体中的细胞。
[0008]血小板是血液中的“第一反应者”。血小板可由骨髓干细胞产生。人生长培养基的最常用来源是人血小板裂解物。血小板裂解物还用于促进关节和牙齿的愈合，以及用于治疗疾病，例如影响全世界超过2亿人的干眼综合征。许多公司都出售用于细胞培养的人血小板裂解物(Klatte
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Schulz et.al.,Int JMol Sci,2018.19(1))。大多数人血小板裂解物由成人血浆制备，所述成人血浆通过离心成人外周血以获得富血小板血浆(PRP)、单核细胞(MNC)和红细胞部分(RCF)而收集。许多制造PRP的团体和公司都将MNC和PRP合并。大多数血小板最终在血浆层中，但具有粘性并可能被困在MNC层或RCF中。通常大多数从成人血液中采集血小板的设备都将MNC和PRP合并，从而造成MNC浪费。冷冻的血小板显示出活化反应降低和信号传导受损(Waters et.al.,Transfusion,2017.57(12):p.2845
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2857)。血小板裂
解物的标准尚未确定(Astori,G.,et al.,Stem Cell Res Ther,2016.7(1):p.93)。
[0009]外泌体是直径为50
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150nm的小的EV。外泌体产生自多囊泡体(multivesicular body，MVB)向内芽生形成的内体，并且具有靶向特定细胞的表面蛋白。MVB与细胞的外质膜融合，以将外泌体释放到细胞外空间。细胞通过外泌体相互发送信息。
[0010]UCB外泌体发挥对细胞显著的有益治疗和生长作用，以及对脑、心脏以及其他器官和组织的抗免疫、再生和其他作用。UCB外泌体是胎盘与发育中的胎儿交流的主要方式，并且可能含有刺激细胞生长和分化的转录因子、mRNA和μRNA。胎盘外泌体具有抗免疫作用，使细胞能够分泌和表达关闭免疫细胞的分子。
[0011]血浆还含有纤维蛋白原、凝血因子以及白蛋白和球蛋白(分别占血浆蛋白的50％和40％以上)。血浆纤维蛋白原和凝血因子可用于治疗患有纤维蛋白原血症和凝血功能障碍的患者，其与凝血酶组合时还可用作手术胶。白蛋白是细胞悬浮液的重要赋形剂。白蛋白是许多激素、细胞因子和药物的运载分子。球蛋白包括所有类型的免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM等)以及其他可作为信号传导分子的球蛋白。纤维蛋白原通常通过冷沉淀(cryoprecipitation)来分离，而白蛋白通常通过化学方法提取。
[0012]分离外泌体的传统方法效率低且劳动强度大，需要在蔗糖梯度中长时间(大于18小时)超速离心(大于100,000g)。与超速离心相关的离心力和蔗糖梯度的渗透力可能会破坏外泌体并将其内容物释放到细胞外液体中。其他分离外泌体的方法包括抗体包被的磁性微珠和用疏水成分提取。
[0013]因此，仍然需要更有效且高效的方法来从组织、血液、尿液、唾液、眼液和其他体液中分离血小板、外泌体、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白和EV，以使用这些组分提高培养基支持人和其他细胞生长和分化的能力以及用于治疗各种疾病。

技术实现思路

[0014]本文描述了用于分级(fractionating)和分离(isolating)血小板、血小板和细胞外囊泡衍生(platelet
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and extracellular vesicle
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derived)的生长因子、外泌体、球蛋白、纤维蛋白原和白蛋白的新方法，以及使用分离的血小板、血小板和细胞外囊泡衍生的生长因子、外泌体、球蛋白、纤维蛋白原和白蛋白在受试者中再生组织，治疗受试者的纤维蛋白原血症或凝血缺陷，以及治疗受试者的干眼综合征、骨科疾病或牙科疾病的方法。本文所述的一些方法包括从富血小板血浆(platelet
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rich
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plasma，PRP)分离和冷冻干燥血小板以获得去血小板血浆(platelet
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depleted plasma，PDP)，所述PDP是用于细胞培养的生长因子和外泌体的极好来源。这些方法包括从PDP中提取大于90％的外泌体，并从剩余的血浆分离和冷冻干燥白蛋白、球蛋白和凝血蛋白。本文还描述了激活PDP的方法。在下文所述的实验中，如本文所述的激活PDP的方法产生了含有1％PDP的细胞培养基，其刺激Hela细胞生长的效果与10％胎牛血清(FBS)相当或优于10％胎牛血清(FBS)。本文还描述了用于培养哺乳动物(例如人)细胞的生长培养基。
[0015]本文还描述了从UCB制备PDP和使用浓缩的CaCl2溶液激活UCB PDP以刺激细胞培养中细胞生长的方法。从UCB PDP提取外泌体的方法包括使用超声处理的聚乙二醇(PEG)和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从组织来源分离血小板和细胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括：i.提供血小板和EV的组织来源；ii.以第一速度对所述组织来源进行离心，然后以高于所述第一速度的第二速度离心，以分离包含血浆、血小板和EV的富血小板血浆(PRP)层；iii.用包含直径为0.22μm的孔的微孔过滤器过滤所述PRP层，以从所述PRP层中分离血小板和直径大于220nm的颗粒，产生附着在所述微孔过滤器上的分离的血小板和基本上由直径小于约220nm的颗粒组成的血浆滤出物；iv.在使生长因子从所述分离的血小板中释放出来的条件下，在容器中冷冻干燥所述微孔过滤器；和v.处理所述血浆滤出物以分离直径小于约220nm的EV。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(v)中所述直径小于约220μ的EV包括直径为50
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150μ的外泌体。3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(iv)之后将所述容器储存在约
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20℃或更低的温度下。4.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：vi.将培养基添加到所述容器中以解冻和溶解所述生长因子，产生包含所述生长因子的生长溶液；和vii.从所述容器中取出所述生长溶液。5.如权利要求1所述的方法，其中所述组织来源选自脐带血(UCB)、脐带、脐带内衬层、脐带基质细胞(华通氏胶)、羊水、羊膜、胎盘和外周血。6.如权利要求1所述的方法，其中所述微孔过滤器去除了直径大于220nm的颗粒。7.如权利要求1所述的方法，其中所述容器包括封闭系统。8.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述包括：在包含根据权利要求4所述的方法制备的生长溶液的培养基中，培养哺乳动物细胞群体。9.如权利要求8所述的方法，其中所述哺乳动物细胞群体是人细胞。10.如权利要求8所述的方法，其中所述组织来源是UCB。11.细胞培养基，其包含根据权利要求4所述的方法制备的生长溶液。12.一种产生去血小板血浆(PDP)的方法，所述方法包括：i.获取和解冻UCB；ii.离心所述UCB，产生富血小板血浆(PRP)部分；iii.分离所述PRP部分；iv.通过离心贫血小板血浆(PPP)或过滤PDP和细胞碎片以及大于220nm的细胞外囊泡来去除血小板，产生包含柠檬酸磷酸右旋葡萄糖(CDP)、外泌体和血浆蛋白的PDP部分。13.如权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括通过将CaCl2添加到所述PDP部分以沉淀CPD，来激活所述PDP部分。14.一种从组织来源分离外泌体、球蛋白、纤维蛋白原和白蛋白中的一种或多种的方法，所述方法包括：i.提供外泌体、球蛋白、纤维蛋白原和白蛋白的组织来源；
ii.用包含直径为0.22μm的孔的微孔过滤器过滤所述组织来源，产生包含外泌体、球蛋白、纤维蛋白原、白蛋白和CPD的血浆滤出物；iii.将所述血浆滤出物添加到第一离心管中的包含聚乙二醇(PEG)的溶液中，使得所述外泌体分配到PEG泡中；iv.将所述第一离心管冷却至2℃至8℃；v.将所述第一离心管离心，使得所述外泌体和PEG形成第一沉淀物，并形成第一上清液，所述第一上清液包含白蛋白、球蛋白、CPD和纤维蛋白原；vi.将所述第一上清液转移到第二离心管中，并冷冻包含外泌体和PEG的所述第一沉淀物以进行储存，vii.将沉淀剂与所述第一上清液混合，以沉淀CPD；viii.过滤所述沉淀剂和第一上清液的混合物以除去所述CPD，产生没有CPD的第二上清液；ix.将所述第二上清液冷却至2℃至8℃，以形成包含纤维蛋白原的冷沉淀物；x.在第三离心管中离心所述冷沉淀物，以形成第二沉淀物和第三上清液，xi.去除包含白蛋白的所述第三上清液，并将包含纤维蛋白原的所述冷沉淀物冷冻干燥；和xii.将含有白蛋白的所述第三上清液冷冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：新泽西鲁特格斯州立大学，
类型：发明
国别省市：