由RNA-适体募集介导的用于靶向基因组修饰的高效DNA碱基编辑器及其用途制造技术

本发明专利技术公开了用于靶向基因编辑的系统和相关用途。还公开了相关的细胞。相关用途。还公开了相关的细胞。

Efficient DNA base editor mediated by RNA aptamer recruitment for targeted genome modification and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由RNA
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适体募集介导的用于靶向基因组修饰的高效DNA碱基编辑器及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年9月17日提交的美国临时申请号62/901,584的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
专利

[0003]本专利技术涉及用于靶向基因组修饰的系统及其用途。

技术介绍

[0004]总的来说，基因编辑技术，例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统，为生物技术和生物医学研究提供了强有力的工具。他们还为基因疾病、癌症、病毒感染等的靶向治疗的系统开发带来了希望。然而，基因编辑技术具有重大的局限性，需要在其广泛应用于临床实践之前加以解决。首先，常规的基因编辑系统依赖于在靶位点产生DNA双链断裂(DSB)，这可能会产生有害后果，尤其是在计划外脱靶活性很高的情况下(1,2)。尽管所开发的诸如配对切口酶(3)、与二聚核酸酶融合的非活性Cas9(4,5)或高保真CRISPR系统(6,7)的策略被认为可以减轻这些不利影响，但由于检测方法限制了对中靶(on
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target)和脱靶(off
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target)诱变的准确评估，基因编辑干预的实际不利影响可能受到低估。最近表明，由CRISPR系统产生的DSB会诱导先前未被注意到的缺失和重排，这些缺失和重排跨越了中靶位点的数千个碱基(8)。同样，在使用纯化的Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物(RNP)(9)的实验(这种方法被认为可以增强靶向特异性)中已经观察到了插入诱变。其次，为了引入精确的修饰，例如点突变，通常需要使靶细胞经历同源依赖性DNA双链断裂修复(HDR)(10,11)。然而，体细胞，尤其是终末分化的体细胞，并不具有高HDR活性，相反却利用容易出错的非同源末端连接(NHEJ)途径(12)。这些发现凸显了对新的基因编辑系统的需求，用以开发安全且有效的治疗。

技术实现思路

[0005]本专利技术在多个方面解决了上述需求。
[0006]在一个方面，本专利技术提供了一种系统，所述系统包含：(i)序列靶向组分(sequence
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targeting component)或编码其的多核苷酸；(ii)RNA支架(RNA scaffold)，或编码其的多核苷酸(例如DNA)；和(iii)第一效应子融合蛋白(first effector fusion protein)，或编码其的多核苷酸。序列靶向组分包含具有(a)序列靶向蛋白和(b)第一尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)抑制肽(UGI)的靶融合蛋白。RNA支架包含(a)核酸靶向基序，其包含与靶核酸序列互补的指导RNA序列(guide RNA sequence)，(b)RNA基序(例如，本文所述的CRISPR基序)，其能够与所述序列靶向蛋白结合，和(c)第一募集RNA基序。第一效应子融合蛋白包含(a)第一RNA结合结构域，其能够与所述第一募集RNA基序结合，(b)接头，和(c)效应子结构域。第一效应子融合蛋白或效应子结构域具有酶活性，例如胞嘧啶脱氨基活性或
腺苷脱氨基活性。在一个实施方案中，一个示例性系统是称为Cas
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RNA适体介导的C向U逆转(CasRCure或CRC)系统。其他示例性系统包括如本文所述的第二代CRC系统CRC_AID(
A
CRCnu，
A
CRCnu.2)和CRC_APOBEC1(
A1
CRCnu.,
A1
CRCnu.2)(u表示系统中存在UGI)。
[0007]在本专利技术的系统中，靶融合蛋白可以包含一个、两个或更多个UGI。RNA支架可以包含一个、两个或更多个募集RNA基序。因此，靶融合蛋白可以进一步包含两个或更多个UGI(例如，第二UGI)。RNA支架可以进一步包含两个或更多个募集RNA基序(例如，第二募集RNA基序)。优选地，一个、多个或所有编码序列经过密码子优化。例如，编码序列靶向蛋白、第一UGI、第二UGI、RNA结合结构域和效应子结构域的多核苷酸中的一个或多个经优化用以在真核细胞(例如，植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达。序列靶向组分和第一效应子融合蛋白中的每一个均可以具有核定位信号(NLS)。例如，序列靶向组分或第一效应子融合蛋白包含一个或多个NLS。在一个实施方案中，序列靶向组分包含两个NLS。在这种情况下，所述两个NLS可以分别位于序列靶向组分的N末端和C末端，如图9C所示。
[0008]在上述系统中，序列靶向蛋白可以是CRISPR蛋白。序列靶向蛋白不具有核酸酶活性。序列靶向蛋白的实例包括选自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的物种的dCas9或nCas9的序列。
[0009]在上述RNA支架中，第一募集RNA基序和第一RNA结合结构域可以是选自以下的一对：(1)端粒酶Ku结合基序和Ku蛋白或其RNA结合部分，(2)端粒酶Sm7结合基序和Sm7蛋白或其RNA结合部分，(3)MS2噬菌体操纵子茎环和MS2外壳蛋白(MCP)或其RNA结合部分，(4)PP7噬菌体操纵子茎环和PP7外壳蛋白(PCP)或其RNA结合部分，(5)SfMu噬菌体Com茎环和Com RNA结合蛋白或其RNA结合部分，(6)上述适体及其相应适体配体或其RNA结合部分的化学修饰形式和(7)非天然RNA适体和相应适体配体或其RNA结合部分。
[0010]效应子融合蛋白可以具有多种合适的酶活性。在一个实施方案中，效应子可以具有胞苷脱氨基活性，例如选自人、大鼠、小鼠、蝙蝠、裸鼹鼠(naked mole rat)、大象、鸡、蜥蜴、巨龟、腔棘鱼和其他脊椎动物物种的AID、CDA、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F或其他APOBEC家族酶的野生型或基因工程形式。在另一个实施方案中，效应子可以具有腺嘌呤脱氨基活性，例如选自细菌、酵母、人、大鼠、小鼠、蝙蝠、裸鼹鼠、大象、鸡、蜥蜴、巨龟、腔棘鱼和其他脊椎动物物种的ADA、ADAR家族酶或tRNA腺苷脱氨酶的野生型或基因工程形式。接头序列的长度可以是0至100(例如，1
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100、5
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80、10
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50和20
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30)个氨基酸残基。
[0011]还提供了编码上述系统的组分(i)
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(iii)的一个或多个的分离的核酸、包含所述核酸的表达载体或包含所述核酸的宿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种系统，其包含：(i)序列靶向组分或编码其的多核苷酸，所述组分包含具有以下的靶融合蛋白：(a)序列靶向蛋白，和(b)第一尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)抑制肽(UGI)；(ii)RNA支架，或编码其的DNA多核苷酸，所述支架包含(a)核酸靶向基序，其包含与靶核酸序列互补的指导RNA序列，(b)RNA基序，其能够与所述序列靶向蛋白结合，和(c)第一募集RNA基序，和(iii)第一效应子融合蛋白，或编码其的多核苷酸，所述蛋白包含(a)第一RNA结合结构域，其能够与所述第一募集RNA基序结合，(b)接头，和(c)效应子结构域，其中所述第一效应子融合蛋白或所述效应子结构域具有胞嘧啶脱氨基活性或腺苷脱氨基活性。2.如权利要求1所述的系统，其中所述靶融合蛋白进一步包含两个或更多个UGI。3.如权利要求1所述的系统，其中所述RNA支架进一步包含两个或更多个募集RNA基序。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的系统，其中将编码所述序列靶向蛋白、所述第一UGI、所述第二UGI、所述RNA结合结构域和所述效应子结构域的多核苷酸中的一个或多个针对真核细胞或哺乳动物细胞表达进行优化。5.如权利要求1
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4所述的系统，其中所述序列靶向组分或所述第一效应子融合蛋白包含一个或多个核定位信号(NLS)。6.如权利要求5所述的系统，其中所述序列靶向组分包含两个NLS。7.如权利要求1所述的系统，其中所述序列靶向蛋白是CRISPR蛋白。8.如权利要求1所述的系统，其中所述序列靶向蛋白不具有核酸酶活性。9.如权利要求1
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8中任一项所述的系统，其中所述序列靶向蛋白包含选自以下的物种的dCas9或nCas9的序列：化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。10.如权利要求1
‑
9中任一项所述的系统，其中所述第一募集RNA基序和所述第一RNA结合结构域是选自以下的一对：端粒酶Ku结合基序和Ku蛋白或其RNA结合部分，端粒酶Sm7结合基序和Sm7蛋白或其RNA结合部分，MS2噬菌体操纵子茎环和MS2外壳蛋白(MCP)或其RNA结合部分，PP7噬菌体操纵子茎环和PP7外壳蛋白(PCP)或其RNA结合部分，SfMu噬菌体Com茎环和Com RNA结合蛋白或其RNA结合部分，以及以上适体及其相应适体配体或其RNA结合部分的化学修饰形式和非天然RNA适体及相应适体配体或其RNA结合部分。11.如权利要求1
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10中任一项所述的系统，其中所述胞苷脱氨基活性的效应子是选自
人、大鼠、小鼠、蝙蝠、裸鼹鼠、大象、鸡、蜥蜴、巨龟、腔棘鱼和其他脊椎动物物种的AID、CDA、APOBEC1、APOBEC3A、APOBEC3B、APO...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晟侃，JC，
申请(专利权)人：新泽西鲁特格斯州立大学，
类型：发明
国别省市：