【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于X连锁青少年型视网膜劈裂症疗法的CRISPR和AAV策略
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年11月8日提交的美国申请第62/932,608号的权益，所述美国申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]对通过EFS WEB作为文本文件提交的序列表的引用
[0004]写入文件694232SEQLIST.txt中的序列表为1.22兆字节，创建于2020年11月6日，并且特此通过引用并入。
技术介绍
[0005]RS1基因编码涉及视网膜的细胞组织的高度保守的胞外蛋白。所述基因由光感受器和双极细胞组装并分泌为同源寡聚蛋白复合物。已在RS1中检测到超过200种突变，其中许多因无功能蛋白或不存在蛋白分泌而导致黄斑变性的早期发作。缺乏功能性Rs1表达会引起视网膜层内的分裂，导致与X连锁青少年型视网膜劈裂症(XLRS)相关的早期和进行性视力丧失。尽管已经有针对XLRS的基因疗法临床试验，但所述试验并未达到其终点。治疗XLRS需要新的策略。
技术实现思路
[0006]提供了允许将视网膜劈裂素编码序列插入到靶基因组基因座如内源性RS1基因座中和/或表达视网膜劈裂素编码序列的核酸构建体和组合物。所述核酸构建体和组合物可以在用于整合到靶基因组基因座和/或在细胞中表达的方法中，或在治疗X连锁青少年型视网膜劈裂症的方法中使用。
[0007]一方面，提供了用于整合到靶基因组基因座中的双向核酸构建体。一些此类核酸构建体包括：(a)第一区段，所述第一区段包括第一视网膜劈裂素蛋白或...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于整合到靶基因组基因座中的核酸构建体，其中所述核酸构建体是双向的并且包括：(a)第一区段，所述第一区段包括第一视网膜劈裂素蛋白或其片段的第一编码序列；以及(b)第二区段，所述第二区段包括第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的第二编码序列的反向补体。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述第二区段定位于所述第一区段的3'端。3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，或者所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段和所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段两者均是人视网膜劈裂素蛋白或其片段。4.根据权利要求1到3中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列包括互补DNA(cDNA)、基本上由其组成或由其组成，所述第二编码序列包括cDNA、基本上由其组成或由其组成，或者所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均包括cDNA、基本上由其组成或由其组成。5.根据权利要求1到4中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列包括人RS1或其简并变体的外显子2
‑
6、基本上由其组成或由其组成，所述第二编码序列包括人RS1或其简并变体的外显子2
‑
6、基本上由其组成或由其组成，或者所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均包括人RS1或其简并变体的外显子2
‑
6、基本上由其组成或由其组成。6.根据权利要求1到5中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的5'端的人RS1的第一内含子的片段或部分，和/或所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的3'端的人RS1的第二内含子的片段或部分的反向补体。7.根据权利要求1到6中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段与所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段相同。8.根据权利要求1到7中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二编码序列采用与所述第一编码序列的密码子使用不同的密码子使用。9.根据权利要求1到8中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二区段与所述第一区段具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％互补性。10.根据权利要求1到9中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二区段与所述第一区段具有小于约30％、小于约35％、小于约40％、小于约45％、小于约50％、小于约55％、小于约60％、小于约65％、小于约70％、小于约75％、小于约80％、小于约85％、小于约90％、小于约95％、小于约97％或小于约99％互补性。11.根据权利要求1到10中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二编码序列的所述反向补体：(a)与所述第一编码序列没有明显互补；(b)与所述第一编码序列的片段没有明显互补；
(c)与所述第一编码序列高度互补；(d)与所述第一编码序列的所述片段高度互补；(e)与所述第一编码序列的所述反向补体至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％相同；(f)与所述第一编码序列的所述反向补体约50％到约80％相同；或者(g)与所述第一编码序列的所述反向补体约60％到约100％相同。12.根据权利要求1到11中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段通过连接子与所述第二区段连接。13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其中所述连接子的长度为约5到约2000个核苷酸。14.根据权利要求1到13中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的3'端的第一聚腺苷酸化信号序列，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的5'端的第二聚腺苷酸化信号序列的反向补体。15.根据权利要求14所述的核酸构建体，其中所述第一聚腺苷酸化信号序列不同于所述第二聚腺苷酸化信号序列。16.根据权利要求1到15中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体不包括驱动所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。17.根据权利要求1到16中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的5'端的第一剪接受体位点，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的3'端的第二剪接受体位点的反向补体。18.根据权利要求17所述的核酸构建体，其中所述第一剪接受体位点来自RS1基因，所述第二剪接受体位点来自RS1基因，或者所述第一剪接受体位点和所述第二剪接受体位点两者均来自RS1基因。19.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中所述第一剪接受体位点来自人RS1的内含子1，所述第二剪接受体位点来自人RS1的内含子1，或者所述第一受体位点和所述第二剪接受体位点两者均来自人RS1的内含子1。20.根据权利要求1到19中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体不包括同源臂。21.根据权利要求1到19中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括同源臂。22.根据权利要求1到21中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是单链的。23.根据权利要求1到21中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是双链的。24.根据权利要求1到23中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括DNA。25.根据权利要求1到24中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列被密码子优化以在宿主细胞中表达，所述第二编码序列被密码子优化以在所述宿主细胞中表达，或者所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均被密码子优化以在所述宿主细胞中表达。26.根据权利要求1到25中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括以下末端结构中的一个或多个末端结构：发夹、环、反向末端重复序列(ITR)或超环面。
27.根据权利要求26所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括ITR。28.根据权利要求1到27中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段和/或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段包括与SEQ ID NO:5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。29.根据权利要求1到28中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列和/或所述第二编码序列包括与SEQ ID NO:8或9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。30.根据权利要求1到29中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一编码序列包括与SEQ ID NO:8至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成，并且其中所述第二编码序列包括与SEQ ID NO:9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。31.根据权利要求1到30中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括与SEQ ID NO:46或47至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。32.根据权利要求1到31中任一项所述的核酸构建体，其中所述第二区段定位于所述第一区段的3'端，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段和所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段两者均是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，其中所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段与所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段相同，其中所述第一编码序列和所述第二编码序列两者均包括互补DNA(cDNA)，所述cDNA包括人RS1或其简并变体的外显子2
‑
6，其中所述第二编码序列采用与所述第一编码序列的密码子使用不同的密码子使用，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的3'端的第一聚腺苷酸化信号序列，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的5'端的第二聚腺苷酸化信号序列的反向补体，其中所述第一区段包括定位于所述第一编码序列的5'端的第一剪接受体位点，并且所述第二区段包括定位于所述第二编码序列的所述反向补体的3'端的第二剪接受体位点的反向补体，其中所述核酸构建体不包括驱动所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子，并且其中所述核酸构建体不包括同源臂。33.一种载体，其包括根据权利要求1到32中任一项所述的核酸构建体。
34.根据权利要求33所述的载体，其中所述载体是病毒载体。35.根据权利要求34所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。36.根据权利要求35所述的载体，其中所述AAV包括单链基因组(ssAAV)。37.根据权利要求35所述的载体，其中所述AAV包括自身互补型基因组(scAAV)。38.根据权利要求35到37中任一项所述的载体，其中所述AAV选自由以下组成的组：AAV2、AAV5、AAV8或AAV7m8。39.根据权利要求33到38中任一项所述的载体，其中所述载体不包括驱动所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。40.根据权利要求33到39中任一项所述的载体，其中所述载体不包括同源臂。41.根据权利要求33到39中任一项所述的载体，其中所述载体包括同源臂。42.一种脂质纳米颗粒，其包括根据权利要求1到32中任一项所述的核酸构建体。43.一种细胞，其包括根据权利要求1到32中任一项所述的核酸构建体。44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述细胞在体外。45.根据权利要求43所述的细胞，其中所述细胞在体内。46.根据权利要求43到45中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。47.根据权利要求46所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。48.根据权利要求43到47中任一项所述的细胞，其中所述细胞是视网膜细胞。49.根据权利要求43到48中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达所述第一视网膜劈裂素蛋白或其片段或所述第二视网膜劈裂素蛋白或其片段。50.根据权利要求43到49中任一项所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述靶基因组基因座处。51.根据权利要求50所述的细胞，其中所述靶基因组基因座是内源性RS1基因座。52.根据权利要求50所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述内源性RS1基因座的内含子1中。53.根据权利要求52所述的细胞，其中内源性RS1外显子1剪接至所述核酸构建体的所述第一编码序列或所述第二编码序列中。54.根据权利要求53所述的细胞，其中包括在基因组上整合的核酸构建体的经修饰的RS1基因座编码包括与SEQ ID NO:2或4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成的蛋白质。55.根据权利要求51到54中任一项所述的细胞，其中将所述核酸构建体整合到所述内源性RS1基因座中阻止整合位点下游的内源性RS1基因转录。56.根据权利要求55所述的细胞，其中所述将所述核酸构建体整合到所述内源性RS1基因座中减少或消除内源性视网膜劈裂素蛋白的表达，并且用由所述核酸构建体编码的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达替代所述内源性视网膜劈裂素蛋白的表达。57.根据权利要求55或56中任一项所述的细胞，其中所述内源性RS1基因座包括突变的RS1基因，所述突变的RS1基因包括引起X连锁青少年型视网膜劈裂症的突变，并且所述在基因组上整合的核酸构建体的表达降低或消除所述突变的RS1基因的表达。58.一种用于同源非依赖性靶向整合到靶基因组基因座中的核酸构建体，其中所述核
酸构建体包括视网膜劈裂素蛋白或其片段的在每一侧上侧接有核酸酶药剂的核酸酶靶序列的编码序列。59.根据权利要求58所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体中的所述核酸酶靶序列与用于整合到所述靶基因组基因座中的核酸酶靶序列相同，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列在所述核酸构建体以正确朝向插入时被破坏，但在所述核酸构建体以相反朝向插入到所述靶基因组基因座中时被重整。60.一种用于与靶基因组基因座同源重组的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括视网膜劈裂素蛋白或其片段的在每一侧上侧接有同源臂的编码序列，任选地其中所述编码序列和所述同源臂在每一侧上进一步侧接有核酸酶药剂的核酸酶靶序列，并且任选地其中每个同源臂的长度介于约25个核苷酸与约2.5kb之间。61.根据权利要求58到60中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段。62.根据权利要求58到61中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括互补DNA(cDNA)、基本上由其组成或由其组成。63.根据权利要求58到62中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括人RS1或其简并变体的外显子2
‑
6、基本上由其组成或由其组成。64.根据权利要求58到63中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的人RS1的第一内含子的片段或部分。65.根据权利要求58到64中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。66.根据权利要求58到65中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的3'端的聚腺苷酸化信号序列。67.根据权利要求58到66中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的剪接受体位点。68.根据权利要求67所述的核酸构建体，其中所述剪接受体位点来自RS1基因。69.根据权利要求68所述的核酸构建体，其中所述剪接受体位点来自人RS1的内含子1。70.根据权利要求58到69中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是单链的。71.根据权利要求58到69中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是双链的。72.根据权利要求58到71中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括DNA。73.根据权利要求58到72中任一项所述的核酸构建体，其中所述编码序列被密码子优化以在宿主细胞中表达。74.根据权利要求58到73中任一项所述的核酸构建体，其中所述构建体包括以下末端结构中的一个或多个末端结构：发夹、环、反向末端重复序列(ITR)或超环面。75.根据权利要求74所述的核酸构建体，其中包括所述编码序列和所述核酸酶靶序列的所述核酸构建体的区侧接有ITR。76.根据权利要求58到75中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸酶药剂为Cas蛋白和向导RNA，并且所述核酸酶靶序列为向导RNA靶序列。77.根据权利要求76所述的核酸构建体，其中所述向导RNA靶序列为反向向导RNA靶序
列。78.根据权利要求76或77所述的核酸构建体，其中所述Cas蛋白是Cas9。79.根据权利要求58到78中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段包括与SEQ ID NO:5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。80.根据权利要求58到79中任一项所述的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括与SEQ ID NO:8或9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。81.根据权利要求58到80中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括与SEQ ID NO:45至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成。82.根据权利要求58、59和61到81中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是所述用于同源非依赖性靶向整合到所述靶基因组基因座中的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括包含人RS1或其简并变体的外显子2
‑
6的互补DNA(cDNA)，其中所述核酸构建体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的3'端的聚腺苷酸化信号序列，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的剪接受体位点，并且其中所述核酸构建体中的所述核酸酶靶序列与用于整合到所述靶基因组基因座中的核酸酶靶序列相同，其中所述靶基因组基因座中的所述核酸酶靶序列在所述核酸构建体以正确朝向插入时被破坏，但在所述核酸构建体以相反朝向插入到所述靶基因组基因座中时被重整。83.根据权利要求60到81中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体是所述用于与所述靶基因组基因座同源重组的核酸构建体，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段是人视网膜劈裂素蛋白或其片段，其中所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列包括包含人RS1或其简并变体的外显子2
‑
6的互补DNA(cDNA)，其中所述核酸构建体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的3'端的聚腺苷酸化信号序列，其中所述核酸构建体包括定位于所述编码序列的5'端的剪接受体位点，并且其中每个同源臂的长度介于约25个核苷酸与约2.5kb之间。84.一种载体，其包括根据权利要求58到83中任一项所述的核酸构建体。85.根据权利要求84所述的载体，其中所述载体是病毒载体。86.根据权利要求85所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。87.根据权利要求86所述的载体，其中所述AAV包括单链基因组(ssAAV)。
88.根据权利要求86所述的载体，其中所述AAV包括自身互补型基因组(scAAV)。89.根据权利要求86到88中任一项所述的载体，其中所述AAV选自由以下组成的组：AAV2、AAV5、AAV8或AAV7m8。90.根据权利要求84到89中任一项所述的载体，其中所述载体不包括驱动所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的表达的启动子。91.根据权利要求84到90中任一项所述的载体，其中所述载体不包括同源臂。92.一种脂质纳米颗粒，其包括根据权利要求58到83中任一项所述的核酸构建体。93.一种细胞，其包括根据权利要求58到83中任一项所述的核酸构建体。94.根据权利要求93所述的细胞，其中所述细胞在体外。95.根据权利要求93所述的细胞，其中所述细胞在体内。96.根据权利要求93到95中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。97.根据权利要求96所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。98.根据权利要求93到97中任一项所述的细胞，其中所述细胞是视网膜细胞。99.根据权利要求93到98中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达所述视网膜劈裂素蛋白或其片段。100.根据权利要求93到99中任一项所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述靶基因组基因座处。101.根据权利要求100所述的细胞，其中所述靶基因组基因座是内源性RS1基因座。102.根据权利要求100所述的细胞，其中所述核酸构建体在基因组上整合在所述内源性RS1基因座的内含子1中。103.根据权利要求102所述的细胞，其中内源性RS1外显子1剪接至所述核酸构建体中的所述视网膜劈裂素蛋白或其片段的所述编码序列中。104.根据权利要求103所述的细胞，其中包括在基因组上整合的核酸构建体的经修饰的RS1基因座编码包括与SEQ ID NO:2或4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列、基本上由其组成或由其组成的蛋白质。105.根据权利要求101到104中任一项所述的细胞，其中将所述核酸构建体整合到所述内源性RS1基因座中阻止整合位点下游的内源性RS1基因转录。106.根据权利要求105所述的细胞，其中所述将所述核酸构建体整合到所述内源性RS1基因...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。