一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒及方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及幽门螺杆菌诊断的分子检测
，具体涉及一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(H.pylori)是一种革兰氏阴性菌，是常见的最普遍的细菌感染。据报道，世界上一半以上的人口均受到不同程度的幽门螺杆菌的感染，发病率和死亡率都很高。患病率从瑞士的18.9％到尼日利亚的87.7％不等。感染后可导致多种胃部异常疾病，是消化性溃疡病、萎缩性胃炎、胃腺癌和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要病因。幽门螺杆菌已被国际癌症研究机构(IARC)列为人类致癌物(I类致癌物)；当前针对hp的感染主要通过免疫组化染色、快速尿素酶试验和培养等侵入性检测和呼吸尿素呼气试验、粪便抗原检测和血清学分析等非侵入性检测来诊断。尽管这些检测的水平一直在提高，但它们的敏感性、成本效益、优点和缺点彼此不同，如免疫组化的方法，检测费用高，周期长，细菌培养的方法则技术要求高，C
13
的检测方法虽然简便灵敏，但需要特殊设备才能完成检测过程。因此不提倡使用单一测试来诊断幽门螺杆菌感染。有必要开发一种具有更优异灵敏度和选择性的检测方法，为方便医疗资源匮乏的地区提供更加简洁快速的技术服务。
[0003]在Hp的致病过程中，尿素酶被证实是与hp致病密切相关的蛋白，既是定植因子又是毒力因子，它是Hp的一种主要的表面蛋白，具有高度的免疫原性，引起机体产生较强的免疫应答。通过检测尿素酶基因来确定Hp的感染情况，并进行菌株的鉴别及流行病学调查。为HP的早期临床筛查提供技术支撑。
[0004]CRISPR
‑
Cas系统是一种高效、实用的基因编辑工具，被广泛应用于基因组编辑和调控机制研究。其高灵敏度和高特异性，使其在病原体检测、单核苷酸多态性(SNP)分析以及基因突变检测等发挥了极其重要的作用。二类V型Cas12蛋白因其特殊的RuvC结构域，在CrRNA引导下精准识别下游18
‑
25nt的靶DNA，形成三元复合物，进一步启动附属切割ssDNA，产生荧光信号。CRISPR/Cas12a的检测灵敏度高，达到10
‑
18mol/L的aM级别。近年来基于此开发了一系列高灵敏的检测方法，具有广泛的应用前景。该在病原微生物检测中有所研究，但在幽门螺杆菌的检测方面，国内外尚未看到应用结合基因编辑原理的检测技术。
[0005]国际指南中提出幽门螺杆菌的检测中，灵敏度和可视化的检测方法很重要，这对于治疗选择和根除成功具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒及方法，从而解决现有技术缺乏一种具有优异灵敏度和选择性的幽门螺杆菌检测方法的问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]根据本专利技术的第一方面，提供一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒，包括：UreB基因的RPA引物及CrRNA、Ca s12a酶和ssDNA荧光探针；其中，所述UreB基因的RPA引物的核苷酸序列为：RPA
‑
Y
‑
276
‑
F:5
’‑
TGCACATCGTATTTGTCCGCAACATCTAA
‑3’
；RPA
‑
Y
‑
276
‑
R:5
’‑
AGATGGCAAAATCGCTGGCATTGGCAAAGGCGGTAA
‑3’
；所述UreB基因的CrRNA的核苷酸序列为：UreB
‑
CrRNA
‑
1:5
’‑
AAUU UCUACUGUUGUAGAUAUCGUAACUGCUGGUGGUAUUGAC
‑3’
；或U reB
‑
CrRNA
‑
2:5
’‑
AAUUUCUACUGUUGUAGAUGCAAGCGGUGUAACAACC AUGAUU
‑3’
。
[0009]优选地，所述ssDNA荧光探针中的碱基数为8NT
‑
14NT。
[0010]根据本专利技术的一个优选方案，所述ssDNA荧光探针中的碱基数为12NT，所述ssDNA荧光探针结构为FT
‑
HEX
‑
12NT
‑
BHQ1，具体序列为：5
’‑
HEX
‑
TTTTTTTTTTTT
‑
BHQ1
‑3’
。
[0011]根据本专利技术的另一优选方案，所述ssDNA荧光探针为试纸条LFD探针LFD
‑
FITC
‑
8NT
‑
Biotin，具体序列为：5
’‑
FITC
‑
TTTTTTTT
‑
Biotin
‑3’
。
[0012]进一步，所述试剂盒还包含相应的UreB基因片段的质粒标准品。
[0013]根据本专利技术的第二方面，提供一种利用所述试剂盒快速检测幽门螺杆菌的RPA检测方法，包括以下步骤：1)将RPA扩增体系预混物均匀分配到反应管中充分混合，所述反应管中含有RPA扩增用酶的试剂盒冻干颗粒；所述RPA扩增体系预混物包括：26.5
‑
32.5μL的RPA缓冲液、终浓度为0.24
‑
1μM的上游引物、终浓度为0.24
‑
1μM的下游引物、ddH2O和靶标DNA；2)将终浓度为500
‑
900mM MgOAc转移到试管盖上；3)反应混合管倒置数次混合均匀，于35
‑
42℃恒温反应12
‑
15min，获得RPA扩增产物；4)对RPA扩增产物进行CRISPR
‑
Cas12a附属切割并进行荧光检测或试纸条检测。
[0014]进一步，步骤4)中，进行CRISPR
‑
Cas12a附属切割及荧光检测过程为：将步骤3)中的RPA扩增产物加入由DEPC水、缓冲液、Cas12a酶、CrRNA、RNA酶抑制剂和ssDNA荧光探针组成的Cas12a酶解反应体系中，置于35
‑
42℃均可的恒温扩增仪中酶切15
‑
45min，反应结束时测定荧光值。
[0015]其中，CRISPR
‑
Cas12a附属切割体系中包括：1
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒，包括：UreB基因的RPA引物及CrRNA、Cas12a酶以及ssDNA荧光探针；其中，所述UreB基因的RPA引物的核苷酸序列为：RPA
‑
Y
‑
276
‑
F：5
’‑
TGCACATCGTATTTGTCCGCAACATCTAA
‑3’
；RPA
‑
Y
‑
276
‑
R：5
’‑
AGATGGCAAAATCGCTGGCATTGGCAAAGGCGGTA A
‑3’
；所述UreB基因的CrRNA的核苷酸序列为：UreB
‑
CrRNA
‑
1：5
’‑
AAUUUCUACUGUUGUAGAUAUCGUAACUGC UGGUGGUAUUGAC
‑3’
；或UreB
‑
CrRNA
‑
2：5
’‑
AAUUUCUACUGUUGUAGAUGCAAGCGGUGUAAC AACCAUGAUU
‑3’
。2.根据权利要求1所述基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针中的碱基数为8NT
‑
14NT。3.根据权利要求2所述基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针中的碱基数为12NT，所述ssDNA荧光探针结构为FT
‑
HEX
‑
12NT
‑
BHQ1，序列为：5
’‑
HEX
‑
TTTTTTTTTTTT
‑
BHQ1
‑3’
。4.根据权利要求1所述基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针为试纸条LFD探针LFD
‑
FITC
‑
8NT
‑
Biotin，序列为：5
’‑
FITC
‑
TTTTTTTT
‑
Biotin
‑3’
。5.根据权利要求1所述基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，还包含相应的UreB基因片段的质粒标准品。6.一种非疾病的诊断和治疗目的的快速检测幽门螺杆菌的RPA检测方法，其特征在于，使用一种根据权利要求1～5中任意一项所述的基于RPA
‑
CRISPR
‑
Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒对待检测样本进行检测，包括以下步骤：1)将RPA扩增体系预混物均匀分配到反应管中充分混合，所述反应管中含有RPA扩增用酶的试剂盒冻干颗粒；所述RPA扩增体系预混物包括：26.5
‑
32.5μL的RPA缓冲液、终浓度为0.24
‑
1μM的上游引物、终浓度为0.24
‑
1μM的下游引物、ddH2O和靶标DNA；2)将终浓度为500
‑
900mM的醋...

【专利技术属性】
技术研发人员：张清连，唐雪明，赵岩云，
申请(专利权)人：上海硅羿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：