检测结核分枝杆菌多重耐药基因的引物探针组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测结核分枝杆菌多重耐药基因的引物探针组合及试剂盒。所述引物探针组合包括检测rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因的引物对和检测基因突变位点的探针。本发明专利技术利用了多重Taqman荧光探针技术，按基因耐药种类(利福平/异烟肼/链霉素/乙胺丁醇)标记不同的荧光，通过检测不同通道的荧光信号，通过数字PCR技术进行结核耐药基因的区分检测，大大提高了检测的灵敏度和扩增效率。本发明专利技术提供的检测试剂盒，从上样到获取检测结果仅需2

【技术实现步骤摘要】
检测结核分枝杆菌多重耐药基因的引物探针组合及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及检测结核分枝杆菌多重耐药基因的引物探针组合及试剂盒。

技术介绍

[0002]结核病是单一传染病中的头号杀手，长期以来对人类健康带来了巨大威胁。据2019年世界卫生组织(WHO)报告，全世界约有1/4人口感染结核分枝杆菌(MTB)，每年全球结核病新增患病人数超过1000万人次，且以肺结核最为常见。随着耐药结核菌株增加，人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核双重感染患者逐年增多，每年因结核病死亡人数超过180万。因此，及早发现、诊断结核病患者对结核病疫情控制具有关键作用。由于结核分枝杆菌的生长十分缓慢，传统的药敏试验需要长达1～2个月时间，不能及时指导临床用药，可能使感染耐药结核的病人在该期间得不到正确的治疗。因此，快速，灵敏，特异检测结核杆菌耐药性的方法对结核病的早期诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。
[0003]利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇是治疗结核的四种一线药物，基因突变导致耐药性，影响治疗效果。利福平耐药主要发生在rpoB基因，其中516、526、531密码子突变较常见；异烟肼耐药和katG基因315密码子、inhA启动子
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15位点突变相关；乙胺丁醇耐药主要由embB基因306密码子突变引起；链霉素耐药是由rpsl基因第43密码子突变导致。目前临床上检测耐药性方法主要可以分为表型检测(细菌培养)和基因检测两类，并以前者为主。由于结核菌生长缓慢，需要长达1～2个月时间，而基因检测的方法主要是测定与耐药性产生密切相关的基因的位点突变。已报道的基因检测方法有：荧光定量PCR，线性探针杂交技术，间隔区寡核苷酸分型技术，环介导等温扩增技术(LAMP)，基因芯片技术，基因组测序等，但这些都只是用于定性，无法准确定量。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是，提供检测结核分枝杆菌多重耐药基因的引物探针组合及试剂盒，旨在提供一种灵敏、特异并定量的检测方法。
[0005]本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
[0006]检测结核分枝杆菌多重耐药基因的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测rpoB基因、katG基因、inhA基因、rpsL基因、embB基因其中至少其一种基因的引物对和检测基因突变位点的探针；
[0007]其中，检测rpoB基因的引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；检测rpoB 516GAC
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GTC突变的探针序列如SEQ ID NO.3，检测rpoB 526CAC
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TAC突变的探针序列如SEQ ID NO.7、检测rpoB 526CAC
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GAC突变的探针序列如SEQ ID NO.9、检测rpoB 531TCG
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TTG突变的探针序列如SEQ IDNO.11所示；
[0008]检测katG基因的引物对的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，检测katG 315AGC
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ACC突变的探针序列如SEQ ID NO.15所示；
[0009]检测inhA基因的引物对的序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，检测inhA 15C
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T突变的探针序列如SEQ ID NO.20所示；
[0010]检测rpsL基因的引物对的序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示，检测rpsl 43AAG
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AGG突变的探针序列如SEQ ID NO.25所示；
[0011]检测embB基因的引物对的序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示；检测embB 306ATG
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CTG突变的探针序列如SEQ ID NO.30所示，检测embB 306ATG
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GTG突变的探针序列如SEQ ID NO.32所示，检测embB 306ATG
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ATA突变的探针序列如SEQ ID NO.34所示，检测embB 306ATG
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ATC突变的探针序列如SEQ ID NO.36所示，检测embB 306ATG
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ATT突变的探针序列如SEQ IDNO.38所示。
[0012]作为优选实施方案，所述引物探针组合还包括检测IS6110基因的引物对和探针，其中，引物对的序列如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示，探针的序列如SEQ ID NO.42所示。
[0013]作为优选实施方案，所述引物探针组合还包括检测内参基因的引物对和探针，其中，引物对的序列如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示，探针的序列如SEQ ID NO.47所示。
[0014]所述探针的5
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端和3
’
端分别修饰荧光基团和淬灭基团；作为优选实施方案，所述荧光基团选自ATTO、FAM、HEX、ROX、CY5、CY5.5；所述猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB。
[0015]本专利技术还提供一种检测结核分枝杆菌多重耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物探针组合。
[0016]所述试剂盒还包括：数字PCR Mix和无核酸酶水。数字PCRMix含有DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等PCR扩增必需组分，可直接市售购买获得。本专利技术中采用的数字PCR Mix为直接购买的产品，货号LSCK200A。
[0017]作为优选实施方案，所述试剂盒中的引物探针在PCR反应体系中的浓度为250nM
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1000nM。这里是指每条引物和探针的浓度范围为250nM
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1000nM。
[0018]作为优选实施方案，所述引物探针组合包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示的引物和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.47所示的探针。
[0019]作为优选实施方案，所述试剂盒PCR反应的程序为：95℃预变性10分钟，1个循环；95℃变性30秒，60℃退火及延伸45秒，45个循环。
[0020]本专利技术还提供了所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO.47所示的探针。9.根据权利要求5所述的检测结核分枝杆菌多重耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒PCR反应的程序为：95℃预变性10分钟，1个循环；95℃变性30秒，60...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，葛光君，侯俊豪，闫文杰，
申请(专利权)人：臻准生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：