一条靶向猪病毒性腹泻病毒S1蛋白的多肽制造技术

本发明专利技术一条靶向猪病毒性腹泻病毒S1蛋白的多肽，借助于机器学习模型，针对PEDV S蛋白晶体结构的S1

【技术实现步骤摘要】
一条靶向猪病毒性腹泻病毒S1蛋白的多肽


[0001]本专利技术涉及与猪病毒性腹泻病毒S1蛋白特异性结合的多肽序列及其应用，属于多肽设计、病毒抑制、药物筛选开发领域。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(PED)在20世纪70年代初首次在欧洲发现，1978年在比利时首次分离到该病毒。据报道，PEDV已经在许多猪的生产地区爆发，包括中国、美国、加拿大和欧洲，它引起严重的肠道疾病，给全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。它编码了四个主要的结构蛋白：穗状体(S)、核衣壳(N)、膜(M)和包膜(E)。其中，S蛋白被类似胰蛋白酶的宿主细胞蛋白酶加工成S1和S2亚基，在病毒附着于宿主细胞的媒介中起着重要作用。PEDV S蛋白中的S1
‑
CTD区域是针对PEDV的抗病毒药物开发的关键目标之一。然而，现有的PED疫苗不能对流行的PEDV感染提供适当的保护。考虑到这一因素，针对新的PEDV菌株的研究对于预防和控制新出现或重新出现的传染病是必要的。
[0003]对于大多数冠状病毒来说，S1亚单位的N端结构域(NTD)附着在细胞碳水化合物上，C端结构域与细胞蛋白受体结合。SARS
‑
CoV
‑
2的S1亚单位的RBD负责病毒受体与宿主细胞受体的结合，但也有相关的冠状病毒感染研究报道，针对SARS
‑
CoV
‑
2的RBD域的合成肽可以阻止病毒进入细胞。因此，RBD是开发病毒附着抑制剂的一个重要目标，甚至包括中和抗体(nAbs)。PEDV S蛋白的S1亚基中的S1
‑
CTD结构域可以刺激动物体产生中和抗体，这也是开发抗病毒肽的一个相对保守的目标。
[0004]肽的结构相对简单，分子量小，因此易于合成和修饰，具有较高的细胞膜穿透性，无细胞毒性，免疫原性小。筛选多肽的常用方法有噬菌体展示技术、mRNA展示技术、组合化学技术、基于计算机的虚拟筛选技术等。然而，这些方法高度依赖高通量的实验筛选，容易增加工作量。而基于结构的分子对接技术可以克服这个问题。分子对接是计算虚拟筛选的关键技术之一，它试图预测配体与蛋白质活性部位的结合方式和亲和力。它具有很多优点，如操作简单、快速，减少了多肽筛选的工作量，缩短了开发周期，提高了筛选成功率等。

技术实现思路

[0005]本专利技术借助于机器学习模型，针对PEDV S蛋白晶体结构的S1
‑
CTD区域解析，通过多肽虚拟筛选技术，筛选到与靶标蛋白具备潜，其多肽序列为FWKHRI(111740)。人工固相合成111740序列，并利用人工表达的PEDV S1蛋白，借助ELISA实验对多肽进行筛选；借助表面等离子共振实验(SPR)鉴定多肽与靶蛋白的亲和力常数；通过CCK
‑
8试剂盒检验多肽111740对细胞毒性；借助荧光定量PCR和间接免疫荧光实验试验其抑制病毒感染的活性，结果表明111740序列可显著抑制PEDV的感染。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]与猪病毒性腹泻病毒S1蛋白特异性结合的多肽序列，所述的多肽序列为FWKHRI。
[0008]所述的多肽序列，其特征在于，包括以上所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序
列所进行的修饰和以此为基础的改造；修饰材料包括但不限制在纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质上；改造材料包括但不限制在天然氨基酸、非天然氨基酸。
[0009]所述的多肽序列在针对猪病毒性腹泻病毒检测和抑制猪病毒性腹泻病毒领域的应用。
[0010]本专利技术的有益效果：
[0011]1、本专利技术基于PEDV S蛋白晶体结构的S1
‑
CTD区域，通过分子对接虚拟筛选技术和机器学习模型，获得一条与PEDV S1特异性结合的多肽序列111740，其多肽序列为FWKHRI。通过表面等离子共振检测，多肽与PEDV S1蛋白的平衡解离常数K
D
为3.603
×
10
‑7M，即3.60μM，说明具备较高的亲和力。
[0012]2、本专利技术设计多肽在细胞水平进行病毒抑制实验，其有效抑制病毒的多肽浓度达3.125μM，病毒抑制效果出众。
附图说明
[0013]图1为111740序列与PEDV S蛋白的对接结果展示。
[0014]图2为111740序列与PEDV S1蛋白的SPR亲和力鉴定结果。图中，曲线自上至下依次为25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM，1.5625μM。其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。
[0015]图3为111740与人工表达PEDV S1蛋白的ELISA鉴定结果。
[0016]图4为111740对Vero细胞毒性的鉴定结果。
[0017]图5为111740抑制PEDV感染Vero细胞的qRT
‑
PCR鉴定结果。
[0018]图6为111740抑制PEDV感染Vero细胞的间接免疫荧光鉴定结果。
具体实施方式
[0019]以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。
[0020]实施例1分子对接及虚拟肽库的筛选
[0021]在蛋白质结构库中下载PEDV S结构数据(PDB ID:6U7K)，删除水分子和其它无关分子，并对侧链完整性进行评估，补充完整侧链基团，并将整个蛋白质结构能量最小化。借助计算机虚拟生成的肽库，与蛋白质结构进行虚拟对接，并计算分子间相互作用的力学参数。以已测定的多肽与蛋白质亲和力常数和相互作用力学为训练集，采用随机森林机器学习方法，建立评估多肽亲和力预测模型。通过预测结果的好坏来进行多肽优劣的筛选，以评估值为最佳(E评分)的多肽为候选多肽，进行下一步多肽合成和功能验证。多肽与蛋白相互作用模型预测结果(见图1)。
[0022]实施例2 111740与与人工表达S1蛋白的亲和力鉴定(SPR)
[0023]1、在把蛋白固定到芯片上之前，需要筛选合适的缓冲液pH，使配体通过静电吸附作用富集到芯片表面附近，达到较好的偶联效果。使用pH 5.5、5.0、4.5、4.0的醋酸钠溶液稀释PEDV S1样品为50μg/mL。上样时间180s，50mM的NaOH作为清洗溶液，根据结果确定使用pH 4.0作为偶联条件。
[0024]2、使用直接偶联法固定PEDV S1至CM5芯片表面。选择通道，将Flow Cell1作为参照通道，Flow cell 2作为样品通道。选择偶联方法为氨基偶联Amine。选择偶联方式为
Specify contact time:以固定的接触时间为偶联标准。点击next，选load sample，取出样品盘，按照表格中的示意图，一一对应放入所需试剂。将样品盘放回托架，点击next；检查缓冲液等，保存方法和结果文件；点击Run，开始正式偶联。偶联完成后会显示最终偶联水平。
[0025]3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与猪病毒性腹泻病毒S1蛋白特异性结合的多肽序列，其特征在于，所述的多肽序列为FWKHRI。2.根据权利要求1所述的多肽序列，其特征在于，包括以上所述的多肽序列为核心，任何对该多肽序列所进行的修饰和以此为基础的改造；修饰材料包括但不限制在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王方雨，张改平，邢广旭，孙雪峰，乔松林，焦文强，冯华，徐倩，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：