一种间充质干细胞高密度高活性的增殖方法及培养基技术

本发明专利技术涉及一种间充质干细胞高密度高活性的增殖方法及培养基。本发明专利技术通过针对多肽库通过的高通量筛选获得特异性促进人脐带间充质干细胞增殖的活性肽M

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞高密度高活性的增殖方法及培养基


[0001]本申请涉及生物领域，具体涉及一种间充质干细胞高密度高活性的增殖方法及培养基。

技术介绍

[0002]干细胞是一群具有自我增殖和多向分化潜能的原始细胞群体，间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族中的一员，属于成体干细胞的范畴。干细胞是一群具有自我增殖和多向分化潜能的原始细胞群体，间充质干细胞(MSCs)是干细胞家族中的一员，属于成体干细胞的范畴。MSCs具有旁分泌或自分泌细胞因子的特点，在干细胞培养上清液中可检测到表皮生长因子、趋化因子、免疫调节因子、营养因子等生物活性物质，是MSCs在人体内发挥作用的基础能力。MSCs达到人体后可分泌趋化因子，这些趋化因子与多条信号通路(如PI3K、p38、ERK等信号通路)参与MSCs的“归巢”进程，主动越过血管内皮细胞迁徙到靶向组织。MSCs分化的组织类型十分广泛，不仅能分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞，还可分化为神经元、胰岛β样细胞、肝样细胞、心肌细胞、上皮细胞等，有效参与组织重建。
[0003]脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，UCMSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。hUCMSCs贴壁后呈成纤维样细胞，传代后细胞为形态相对均一的梭形。表面标志和其他来源的MSCs一样，高表达CD13、CD73、CD90、CD105、CD54、CD29、CD44，低表达HLA
‑
ABC，不表达CD34、CD45、CD14、CD33、CD38、CD133及HLA
‑
DR、
‑
DA、
‑
DP、
‑
DQ等，同时还表达部分人胚胎干细胞的标记和一些转录因子(Oct
‑
4、Sox
‑
2、Nanog等)。研究发现，hUCMSCs既可以分化为具有成熟脂肪细胞结构和功能的细胞，又可以分化为骨细胞和软骨细胞。许多研究发现MSCs通过细胞间接触、分泌各种造血因子及生成骨髓基质而有利于造血干细胞的体外扩增、造血干细胞移植后的归巢及植入、可缩短移植后骨髓造血功能恢复的时间，并在许多动物实验和临床治疗中得到证实；另外，间充质干细胞还可通过直接的细胞接触、分泌细胞因子、诱导嵌合体形成、诱导免疫耐受、对机体免疫具有负调控作用，从而为临床治疗异基因造血干细胞后GVHD的发生开辟了一条新途径。人脐带MSCs还能分泌多种细胞因子，如白介素
‑
6、金属蛋白酶
‑
1/2组织抑制因子、单核细胞趋化蛋白
‑
1、生长相关癌基因、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白4和白介素
‑
8等，从而维持胰岛样细胞团的存活，并提高其胰岛素表达水平。
[0004]但hUCMSCs的研究仍存在亟需解决的问题，例如因分离方法、试剂使用、培养条件、血清使用、添加细胞因子种类、细胞培养密度等不同，造成不同实验室的细胞表型、分化能力、增殖能力、长期培养后的细胞功能等存在较大差异，直接影响了间充质干细胞的应用。对于MSCs的培养，目前还没有统一的方案。所采用的培养基大致有以下几种：IMDM培养基，LG
‑
DMEM培养基，DMEM+F12培养基以及MesencultTM培养基；所应用的血清浓度也有不同的报道：LeeOK所用浓度为20％；程范军等则将2％与10％血清浓度做对比得出的结论是，采用低浓度血清培养体系，更有利于MSCs的倍增和增值维持；而对于MSCs种植密度的选择也没
有统一的认识。但多数实验研究认为，原代培养的脐带血MSCs多在培养24～48h后出现贴壁，1周左右呈梭形，并成克隆性生长，4～5周可达80％以上的融合。起初培养的干细胞中可见多核，形态扁平的破骨样细胞混杂，一般传代至第3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形的间充质干细胞。
[0005]CN111235101A中公开了一种人脐带间充质干细胞培养基及人脐带间充质干细胞的培养方法，其主要通过培养基中添加羧甲基纤维素钠促进细胞的生长和粘附性，丝素蛋白促进细胞的增殖和生长，添加大豆低聚肽、3
‑
吡啶甲酸、辅酶Q10、α
‑
酮戊二酸复配使用，其中的大豆低聚肽和辅酶Q10具有较好的抗氧化作用，促进细胞代谢，提高细胞内酶的活性，α
‑
酮戊二酸和3
‑
吡啶甲酸协同作用，调节蛋白质的代谢，促进蛋白的合成，提高细胞生长速度和增殖数量，提高细胞分泌生长因子的性能。添加微量元素镁、铁、锌、硒，为细胞的生长提供更好的营养环境，进一步促进细胞的生长。提高细胞的活性。CN108865989A中提供了一种脐带间充质干细胞的培养基，包括MEM/F12培养基和常春藤提取物，添加成分包括以下成分：人血清白蛋白、转铁蛋白、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、精氨酸、白血病抑制因子、干细胞因子、β细胞素、甲状旁腺激素、血小板源性生长因子、肿瘤坏死因子α、白细胞介素、促红细胞生成素、促血小板生成素、α
‑
D
‑
葡萄糖、维生素C、白藜芦醇、NaHCO3、神经节苷脂；常春藤提取物为液体，通过常规方法从常春藤的叶中提取，添加的终浓度为20～50mg/L。但是以上的专利都是成分较为复杂，使用的成本较高，而且配置不变。因此，针对脐带间充质干细胞的培养还是缺乏有效的能够快速培养、配置方便的有效促进增殖用的培养基。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过针对多肽库通过的高通量筛选获得特异性促进人脐带间充质干细胞增殖的活性肽M
‑
428。
[0007]具体的，所述的活性肽M
‑
428的氨基酸序列为CFNTIMCGALS。
[0008]进一步的，所述的多肽可以通过人工合成的方式制备。
[0009]具体的，本专利技术提供一种能够促进人脐带间充质干细胞增殖、减少细胞凋亡的培养基，所述培养基是在基础培养基的基础上添加了本专利技术的活性肽M
‑
428。
[0010]具体的，本专利技术还提供了活性肽M
‑
428在制备能够促进人脐带间充质干细胞增殖、减少细胞凋亡的培养基中的用途。
[0011]具体的，所述培养基是以DMEM/F12培养基为基础。具体的，DMEM基础培养基和F12基础培养基的体积比为1
‑
3:1，优选为1:1。
[0012]进一步的，所述的培养基还可以是本领域常见的其他用于干细胞的培养基或试剂。
[0013]进一步的，所述干细胞培养基，包含以下组分：水溶性非聚电解质高分子、无机盐类、维生素、氨基酸、葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素或类胰岛素功能替代品如(IGF
‑
1/2)、成纤维生长因子。
[0014]具体的，本专利技术中使用的培养基可以含有本身公知的添加物。作为添加物，只要不妨碍干细胞的增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进脐带间充质干细胞增殖的多肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种用于促进人脐带间充质干细胞增殖、减少细胞凋亡的培养基，其特征在于在DMEM/F12培养基中添加权利要求1所述的多肽制备而成，所述多肽的添加浓度为25μg/ml
‑
200μg/ml。3.权利要求2所述多肽在制备用于促进人脐带间充质干细胞增殖、减少细胞凋亡的培养基中的用途，其中，所述多肽的添加浓度为25μg/ml
‑
200μg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆维山，王忠迪，
申请(专利权)人：成都朋山绥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：