本发明专利技术公开了一种高活性的透明质酸酶突变体及其制备寡聚透明质酸盐的应用，属于酶工程和生物工程技术领域。本发明专利技术提供了一种透明质酸酶突变体，其在野生型透明质酸酶SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的基础上，具有位于第27位天冬氨酸、第175位天冬酰胺、第220位蛋氨酸、第297位丝氨酸、第335位甘氨酸和第342位赖氨酸中的至少一者的突变，相对于野生型的透明质酸酶而言，酶活提高了至少20％，该突变体酶水解大分子的透明质酸或其盐得到寡聚透明质酸或其盐混合物分子量在300～2000Da，底物转化率达到95％以上。本发明专利技术的透明质酸酶突变体显著提高酶活，有助于降低生产成本，提高生产效率，为工业化生产吨级寡聚透明质酸或其盐奠定了基础。了基础。了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种高活性的透明质酸酶突变体及其制备寡聚透明质酸盐的应用
：
[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种高活性的透明质酸酶突变体及其制备寡聚透明质酸盐的应用。
技术介绍
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[0002]透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)是线性大分子酸性黏多糖，是由D
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葡萄糖醛酸和N
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乙酰基氨基葡萄糖经过β
‑
1,4
‑
糖苷键与β
‑
1,3
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糖苷键相互连接的双糖重复结构。透明质酸寡糖是指由HA降解形成，相对分子质量小于10k的寡聚糖。相比于大分子量的HA，HA寡糖具有重要的生理活性与特殊生理功能，它能促进皮肤吸收营养、能增加皮肤弹性与延缓衰老、能促进血管生成与创伤愈合、能调节免疫活性与抗肿瘤，在医药领域应用前景广阔。其制备方式分为物理法、化学法和酶法，物理法操作过程简单，但效率较低，产品稳定性较差。化学法引入化学试剂，造成污染，反应条件复杂，产生大量工业废水，而酶法因为专一高效、条件温和、易控制和产物相对单一的特点而被广泛使用。
[0003]透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)是1928年Duran
‑
Reynals首次从哺乳动物卵巢中提取得到。1971年Meyer根据HAase水解HA的机制不同，将HAase分为三类，第一类酶主要来源于哺乳动物睾丸、动物毒液及溶酶体，是内切
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β
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖苷酶，并伴有转糖苷酶的活性，通过水解HA中β
‑
1,4糖苷键生成以氨基葡萄糖为还原性末端的透明质酸四糖HA4(GlcUA
‑
GlcNAc)2和六糖HA6(GlcUA
‑
GlcNAc)3，最小产物是二糖HA2(GlcUA
‑
GlcNAc)。不仅对HA具有水解作用，也可以将软骨素和硫酸软骨素降解为四糖。第二类酶主要来源于水蛭唾液腺和十二指肠虫，是内切
‑
β
‑
葡萄糖醛酸苷酶，通过水解HA中β
‑
1,3糖苷键生成还原性末端为葡萄糖醛酸的饱和寡糖系列，最终产物是透明质酸四糖HA4(GlcNAc
‑
GlcUA)2和六糖HA6(GlcNAc
‑
GlcUA)3。第三类酶主要来源于细菌、病原真菌以及噬菌体中，通过内切HA中β
‑
1,4糖苷键和β
‑
消去作用可以获得4,5
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不饱和寡糖，最终产物是单一的4,5
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不饱和二糖，因此在232nm处有吸收峰。该类酶同时还可以作用于软骨素和硫酸软骨素。
[0004]目前工业生产寡聚透明质酸或其盐的分子量范围在3000～10000Da，由于透明质酸酶的单位酶活低，产物转化率低，生产成本较高，工艺复杂，无法用酶法大规模的生产更低分子量的寡聚透明质酸或其盐(分子量范围在300～2000Da)。
技术实现思路
：
[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术根据透明质酸酶的晶体结构，通过理性设计得到透明质酸酶的突变体，同时优化了编码透明质酸酶的基因的核苷酸序列，并在毕赤酵母体系中实现表达，为工业化生产吨级寡聚透明质酸或其盐提供了酶活更高的透明质酸酶，进一步降低生产成本。
[0006]本专利技术的技术方案为：
[0007]一种源自日本医蛭(Hirudo nipponia)的透明质酸酶突变体，以野生型透明质酸
酶SEQ ID No.1作为参考序列，具有选自第27位天冬氨酸、第175位天冬酰胺、第220位蛋氨酸、第297位丝氨酸、第335位甘氨酸和第342位赖氨酸的至少一个突变；
[0008]并且所述突变体与SEQ ID NO:1中所示全长序列之间同源的程度至少为99％；
[0009]任选地，所述突变体具有如下至少一项的酶活性：
[0010]i)所述突变体比活性大于5x105(u/mg)；其中活性u是指样品在温度为37℃条件下，每小时(h)从浓度为2mg/mL的透明质酸钠溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位；
[0011]ii)与野生型透明质酸酶相比，具有高出20％的透明质酸酶催化活性。
[0012]所述的透明质酸酶突变体，其中，所述点突变具体为：SEQ ID No.1的第27位的天冬氨酸(D)突变为苯丙氨酸(F)。
[0013]所述的透明质酸酶突变体，其中，所述点突变具体为：SEQ ID No.1的第175位的天冬酰胺(N)突变为精氨酸(R)。
[0014]所述的透明质酸酶突变体，其中，所述点突变具体为：SEQ ID No.1的第220位的蛋氨酸(M)突变为天冬氨酸(D)。
[0015]所述的透明质酸酶突变体，其中，所述点突变具体为：SEQ ID No.1的第297位的丝氨酸(S)突变为色氨酸(W)。
[0016]所述的透明质酸酶突变体，其中，所述点突变具体为：SEQ ID No.1的第335位的甘氨酸(G)突变为组氨酸(H)。
[0017]所述的透明质酸酶突变体，其中，所述点突变具体为：SEQ ID No.1的第342位的赖氨酸(K)突变为酪氨酸(Y)。
[0018]在本专利技术的优选方面，所述透明质酸酶突变体具有氨基酸序列如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示；
[0019]或与所述突变体与SEQ ID NO:2
‑
7中所示全长序列之间同源的程度至少为99％的序列；
[0020]任选地，具有如下至少一项的酶活性：
[0021]i)所述突变体比活性大于5x105(u/mg)；其中活性u是指样品在温度为37℃条件下，每小时(h)从浓度为2mg/mL的透明质酸钠溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位；
[0022]ii)与野生型透明质酸酶相比，具有高出20％的催化活性。
[0023]本专利技术还提供编码所述透明质酸酶突变体的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：
[0024]1)如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ IDNo.12或SEQ ID No.13所示；
[0025]2)与1)所示的核酸序列至少具有85％的同源性，且编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示氨基酸序列的核酸序列；
[0026]3)与1)或2)互补的核酸序列。
[0027]在一些实施方案中，同源性在85％
‑
99％之间。
[0028]在一些实施方案中，同源性为85％、86％、87本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种源自日本医蛭(Hirudonipponia)的透明质酸酶突变体，以野生型透明质酸酶SEQ ID No.1作为参考序列，具有选自第27位天冬氨酸、第175位天冬酰胺、第220位蛋氨酸、第297位丝氨酸、第335位甘氨酸和第342位赖氨酸的至少一个突变；并且所述突变体与SEQ ID NO:1中所示全长序列之间同源的程度至少为99％；任选地，所述突变体具有如下至少一项的酶活性：i)所述突变体比活性大于5x105(u/mg)；其中活性u是指样品在温度为37℃条件下，每小时(h)从浓度为2mg/mL的透明质酸钠溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位；ii)与野生型透明质酸酶相比，具有高出20％的透明质酸酶催化活性。2.如权利要求1所述的透明质酸酶突变体，其中，所述点突变具体为：SEQ ID No.1的第27位的天冬氨酸(D)突变为苯丙氨酸(F)；SEQ ID No.1的第175位的天冬酰胺(N)突变为精氨酸(R)；SEQ ID No.1的第220位的蛋氨酸(M)突变为天冬氨酸(D)；SEQ ID No.1的第297位的丝氨酸(S)突变为色氨酸(W)；SEQ ID No.1的第335位的甘氨酸(G)突变为组氨酸(H)；SEQ ID No.1的第342位的赖氨酸(K)突变为酪氨酸(Y)。3.源自日本医蛭(Hirudonipponia)的透明质酸酶突变体，其序列如SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示；或与SEQ ID NO:2
‑
7中所示全长序列之间同源的程度至少为99％同一性；任选地，所述透明质酸酶突变体具有如下至少一项的酶活性的透明质酸酶突变体：i)所述突变体比活性大于5x105(u/mg)；其中活性u是指样品在温度为37℃条件下，每小时(h)从浓度为2mg/mL的透明质酸钠溶液中降解释放1ug还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位；ii)与野生型透明质酸酶相比，具有高出20％的催化活性。4.编码权利要求1
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3任一项所述透明质酸酶突变体的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：1)如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ IDNo.12或SEQ ID No.13所示；2)与1)所示的核酸序列至少具有85％的同源性，且编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示氨基酸序列的核酸序列；3)与1)或2)互补的核酸序列；优选地，同源...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨琥，刘超，王淳霖，胡远，王朝东，
申请(专利权)人：武汉启瑞药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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