一种β-淀粉酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
淀粉酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种β
‑
淀粉酶突变体及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]麦芽糖是由两个葡萄糖单位经由α
‑
1,4糖苷键连接而成的二糖。因C1羟基位置不同，而有α
‑
和β
‑
两种异构体。麦芽糖香甜可口，营养丰富，具有排毒养颜、补脾益气、润肺止咳等功效，是老少皆宜的食品，主要用于加工焦糖酱色及糖果、果汁饮料、造酒、罐头、豆酱、酱油。
[0003]β
‑
淀粉酶是一种外切型淀粉酶，广泛存在于大麦、小麦、甘薯、大豆等高等植物以及芽孢杆菌属等微生物中，可以从糖原和淀粉的非还原末端依次切割α
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1,4糖苷键，生成麦芽糖。野生型β
‑
淀粉酶的酶活较低，无法满足工业生产的要求，获得酶活提高的β
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淀粉酶突变体具有较高的工业应用价值。工业生产通常利用植物来源或微生物来源的β
‑
淀粉酶和普鲁兰酶的共同作用，将淀粉高效水解成麦芽糖。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种热稳定性提高且酶活提高的β
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淀粉酶突变体，并将该突变体用于生产麦芽糖。
[0005]本专利技术提供了一种β
‑
淀粉酶突变体，以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
‑
淀粉酶为出发序列，进行了如下突变：
[0006](a)将第252位的甘氨酸突变为苏氨酸，命名为G252T；
[0007](b)将第503位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，命名为F503S；
[0008](c)将第252位的甘氨酸突变为苏氨酸，并将第503位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，命名为G252T/F503S。
[0009]本专利技术还提供了编码所述β
‑
淀粉酶突变体的基因。
[0010]本专利技术还提供了携带所述基因的重组表达载体。
[0011]在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列质粒。
[0012]本专利技术还提供一种重组微生物，表达所述β
‑
淀粉酶突变体，或含有所述基因。
[0013]在一种实施方式中，所述重组微生物以大肠杆菌为宿主，以pET系列质粒为表达载体。
[0014]在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
[0015]本专利技术还提供了一种提高β
‑
淀粉酶热稳定性的方法，是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第252位的甘氨酸突变为苏氨酸和/或第503位的苯丙氨酸突变为丝氨酸。
[0016]本专利技术还提供所述β
‑
淀粉酶突变体在制备麦芽糖中的应用。
[0017]在一种实施方式中，所述应用是以所述β
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淀粉酶突变体催化淀粉合成麦芽糖。
[0018]有益效果：
[0019]1)本专利技术在天然β
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淀粉酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造β
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淀粉酶分子结构，分析了突变后残基对酶活的影响，并最终获得了酶活提高的突变菌株(G252T、F503S及组合突变株G252T/F503S)。
[0020]2)天然β
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淀粉酶的半衰期为16.2min，本专利技术提供的β
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淀粉酶突变体G252T/F503S在45℃时半衰期达到84.1min，是天然β
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淀粉酶的半衰期的5.2倍；β
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淀粉酶突变体G252T在45℃时半衰期达到35.4min，是天然β
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淀粉酶的半衰期的2.2倍；β
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淀粉酶突变体F503S在45℃时半衰期达到33.6min，是天然β
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淀粉酶的半衰期的2.1倍。
[0021]3)本专利技术提供的β
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淀粉酶突变体的酶活力得到显著提高。在40℃条件下，对照组为100％的相对酶活，突变体G252T/F503S、G252T、F503S分别具有151.2％、132.4％、124.6％的相对酶活。
[0022]4)本专利技术所得的β
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淀粉酶突变体比野生型更适合于催化淀粉生成麦芽糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。
[0023]5)本专利技术提供的β
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淀粉酶突变体和海藻糖合酶的共表达菌株，可以实现一步法从淀粉合成海藻糖，方便快捷，适合工业生产。
附图说明
[0024]图1为野生型β
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淀粉酶及β
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淀粉酶突变体G252T、F503S、G252T/F503S在50℃条件下的半衰期测试结果。
[0025]图2为野生型β
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淀粉酶及β
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淀粉酶突变体G252T、F503S、G252T/F503S在不同pH下的酶活测试结果。
[0026]图3为野生型β
‑
淀粉酶及β
‑
淀粉酶突变体G252T、F503S、G252T/F503S在不同温度下的酶活测试结果。
具体实施方式
[0027]下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。下述实施例中，涉及的培养基及配方如下：
[0028]LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl。
[0029]LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加2％琼脂。
[0030]下述实施例中所涉及的检测方法如下：
[0031]β
‑
淀粉酶酶活测定方法：取100μL浓度为300μg/mL的纯酶加入到含有10g/L的可溶性淀粉的50mM pH 6.0磷酸氢二钠
‑
磷酸氢二钠缓冲液的900μL反应体系中；于40℃水浴条件下反应10min，然后100℃沸水浴10min终止酶促反应，离心取上清，稀释到10mg/mL，利用HPLC检测反应溶液中麦芽糖的含量。
[0032]酶活定义：定义在40℃、pH 8.5的条件下，每分钟催化淀粉生成lμmol麦芽糖所需的酶量，为一个酶活单位U。
[0033]比酶活：定义为单位蛋白的酶活U/mg。
[0034]实施例1构建含β
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淀粉酶突变体的重组质粒
[0035](1)含有野生型的β
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淀粉酶的重组质粒的构建
[0036]化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型β
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淀粉酶基因，与pET
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28a载体
通过HindⅢ酶和EcoRⅠ酶酶切后连接，制备得到携带野生型β
‑
淀粉酶基因的重组载体pET
‑
28a
‑
amyM。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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淀粉酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β
‑
淀粉酶为出发序列，进行了如下突变：(a)将第252位的甘氨酸突变为苏氨酸；(b)将第503位的苯丙氨酸突变为丝氨酸；(c)将第252位的甘氨酸突变为苏氨酸，并将第503位的苯丙氨酸突变为丝氨酸。2.编码权利要求1所述β
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淀粉酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体包括但不限于pET系列质粒。5.一种重组微生物，其特征在于，表达权利要求1所述的β
‑
淀粉酶突变体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张显，饶志明，房鸣，胡孟凯，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：