一种高比活中温淀粉酶突变体制造技术

本发明专利技术属于基因工程与蛋白质改造技术领域，具体提供了一种高比活中温淀粉酶突变体及其应用。所述淀粉酶突变体包含V26F，N69D，S265K，F351M中至少一个突变位点。与野生型相比，淀粉酶单点突变体的比活力普遍提高了55.2%

【技术实现步骤摘要】
一种高比活中温淀粉酶突变体


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质改造
，具体涉及一种高比活中温淀粉酶突变。

技术介绍

[0002]淀粉酶是一种重要的水解酶类，是水解淀粉和糖原的一类酶的总称，淀粉酶通常作用于直链淀粉、可溶性淀粉、糖元、糊精等α
‑
1,4
‑
葡聚糖糖苷键。淀粉酶分布广泛，几乎存在于所有的动植物和微生物中。最近统计表明淀粉酶产量已经占据酶制剂市场的30%左右，其广泛应用于淀粉制糖业、味精、啤酒等食品发酵行业、饲料以及造纸、纺织印染行业等。
[0003]α
‑
淀粉酶是淀粉酶中应用最广泛的酶种，其可以随机地从内部切断淀粉、糖原内的α
‑
1,4
‑
葡萄糖苷键，将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖。根据其催化作用温度的不同，α
‑
淀粉酶可分为低温α
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淀粉酶、中温α
‑
淀粉酶和耐高温α
‑
淀粉酶。
[0004]中温淀粉酶在适宜的条件下，可以在淀粉分子内部任意切割α
‑
1,4
‑
葡萄糖苷键，使淀粉迅速降解，失去粘性，变成麦芽糖、葡萄糖和糊精等，这个过程通常被称之为淀粉的液化，因此α
‑
淀粉酶被称为液化酶。其中，中温α
‑
淀粉酶在pH6.0
‑
6.5时较稳定，最适pH6.0，在pH5.0以下失活。其作用温度在60℃以下较为稳定，最适作用温度60r/>‑
70℃。
[0005]中温淀粉酶在食品加工、医疗工业、造纸工业、饲料产业等都有较广泛的应用。此外，其在石油开采、有机合成、环境保护等方面的应用正逐步被研究。中温淀粉酶添加在饲料中能够提高幼龄动物生产性能，补充幼龄动物内源性淀粉酶分泌不足，减少各种应激反应对动物的影响，同时也可提高饲料利用率，提高生产性能；其内切效率高，能够高效分解饲料原料的淀粉，提高能量利用率，降低生产成本。
[0006]近年来，随着酶制剂工业的蓬勃发展，品种和产量不断增加，其应用领域也不断拓宽，作为酶制剂产品中重要的一种，中温淀粉酶必将发挥越来越重要的作用。但是由于目前天然微生物表达的中温淀粉酶的产量较低、稳定性差、生产成本高等缺点无法满足市场的需求，进一步阻碍了中温淀粉酶的广泛应用。为得到产量高、稳定性好、活性高的中温淀粉酶，可通过用不同的方式解决：1.通过基因工程改良；2.优化表达系统；3.寻找更合适的宿主等获得更高效价的菌株。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种高比活中温淀粉酶突变体。所述突变体的比活力显著高于野生型，可广泛应用于饲料、食品加工等领域。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术涉及一种淀粉酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：26，69，265，351。
[0009]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至
少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
[0010]在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：V26F，N69D，S265K，F351M。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：V26F；N69D；S265K；F351M；V26F/N69D；V26F/S265K；V26F/F351M；N69D/S265K；N69D/F351M；S265K/F351M；V26F/N69D/S265K；V26F/N69D/F351M；V26F/S265K/F351M；N69D/S265K/F351M；V26F/N69D/S265K/F351M。
[0013]本专利技术还涉及编码上述淀粉酶突变体的DNA分子。
[0014]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0015]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0016]将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的淀粉酶突变体的比活力得到显著提升。
[0017]在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0018]本专利技术还提供了上述淀粉酶突变体在饲料生产或食品加工领域中的应用。
[0019]本专利技术以野生型中温淀粉酶ZD为基础，提供了包含V26F、N69D、S265K和F351M中至少一个突变位点的突变体。与野生型相比，本专利技术提供的淀粉酶单点突变体的比活力普遍提高了55.2%
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147.2%；其中，含V26F单点突变的突变体ZD
‑
1，其比活力最高，达2526 U/mg，取得了意料不到的技术效果。
[0020]本专利技术提供的V26F、N69D、S265K和F351M四个突变位点能显著提高中温淀粉酶ZD的比活力，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。
具体实施方式
[0021]本专利技术公开了一种高比活的中温淀粉酶突变体、其制备方法及应用、编码该淀粉酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参
数实现。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0022]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。例如，本专利技术可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。
[0023]培养基：LB培养基（大肠杆菌培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；YPD培养基（酵母培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：26，69，265，351。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。4.如权利要求1
‑
3任一所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：V26F，N69D，S265K，F351M 。5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静静，鲍锴，吴秀秀，程斯达，康丽华，李馨培，刘文瑶，葛菁华，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：